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白头翁皂苷B4衍生物靶向丙酮酸羧化酶改善结肠炎

城头变幻大王骑

2024/09/18

中药/天然药检测

白头翁皂苷B4（Anemoside B4，AB4）是一种来自白头翁 ( Pulsatilla chinensis)的三萜皂苷，具有显著的抗炎活性，可用于治疗炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）。然而，由于其高分子量和明显的水溶性，其应用受到限制。通过合成AB4衍生物发现治疗IBD的新的有效药物是一种可行的策略。

1、AB4 C-3 连接的寡糖是其抗炎活性的重要基团

在合成两种AB4衍生分子探针的过程中，作者发现AB4-生物素（AB4-Biotin）和AB4-香豆素（AB4-coumarin）与AB4相似，具有抗炎活性。白头翁苷D（pulsatilloside D）没有抗炎作用，白头翁苷D的结构与AB4极其相似，仅与苷元C-3连接的糖链略有不同，这表明糖链可能在其抗炎活性中发挥着至关重要的作用。与AB4相比，两种分子探针仅在苷元的C-28处具有不同的取代基，表明这些基团可以被替换以制备更多的AB4衍生物。然后，通过活性筛选，有可能获得抗炎活性更强、理化性质更好的化合物。

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图1 化学结构（A）AB4,（B）Pulsatilloside D,（C）AB4-Biotin,（D）AB4-coumarin

2、AA3对DSS诱导的结肠炎小鼠没有治疗作用

在作者之前的研究中，使用NaOH去除C-28连接的寡糖，得到白头翁苷A3（AA3），从理化性能来看，AA3较AB4有显著的改进。之前研究发现，AA3可通过抑制PGE2-EP4的激活和Th17细胞分化来减轻EAE小鼠的炎症损伤，同时，AA3还抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路，诱导M1巨噬细胞极化，因此作者评估了AA3对IBD的潜在治疗作用。不幸的是，通过疾病活动指数评分、体重和结肠长度等指标的评估发现AA3对DSS诱导的小鼠结肠炎没有治疗作用。作者在本研究中以AA3为起始原料，设计并合成了一系列AB4衍生物。

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图2 AA3对DSS诱导的结肠炎小鼠没有治疗作用

3、AB4 衍生物的体外抗炎作用

作者首先合成了28种AB4衍生物，其中化合物A3?4、A3?19、A3?27和A3?29表现出较强的细胞毒性，而其余化合物对THP-1细胞的活力影响不大。前期作者发现丙酮酸羧化酶（PC）是AB4治疗IBD的分子靶点，作者本研究发现A3-6、A3-7、A3-10、A3-16、A3-24、A3-26和A3-28抑制PC酶活性与AB4相当。为了探索上述7种AB4衍生物的抗炎活性，作者研究了这七种化合物对NF-κB信号通路激活的影响，因为它已被证明是炎症性疾病的关键信号通路。Western blotting分析结果显示，A3?6和A3?24比AB4更能有效抑制p-IκBα蛋白水平（NF-κB 激活由IκBα的磷酸化介导），并表现出更好的抗炎活性。

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图3 蛋白质印迹检测IκBα

作者进一步证实 A3?6 的抗炎活性，发现A3?6能够以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的p-p65和p-IκBα增加，激活的NF-κB通路促进多种促炎基因的表达，且与AB4 相比表现出优异的抗炎活性。此外，A3?6而不是AB4能够更显著抑制NLRP3炎症小体的激活来减轻炎症反应。

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图4 A3?6通过抑制NF-κB和NLRP3炎症小体途径发挥抗炎作用

4、A3?6 改善DSS诱发的结肠炎

为了评估A3?6对溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果，作者使用DSS诱导的实验性结肠炎模型来评估A3?6的体内抗炎作用，发现A3?6减少了DSS引起的结肠炎小鼠体重减轻，降低疾病活动指数，改善结肠缩短。此外，治疗后体重和器官指数没有明显变化，表明 A3?6 对小鼠的毒性较低。这些结果表明A3?6改善了DSS诱导的实验性结肠炎，且不会对小鼠产生毒性。

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图5 A3?6 改善DSS诱发的结肠炎

5、A3?6 与丙酮酸羧化酶（PC）结合

作者之前的研究通过蛋白质组学发现AB4显著改变了TNBS诱导的大鼠中的丙酮酸代谢和三羧酸（TCA）循环中的蛋白。PC是TCA的关键酶，有报道其参与影响炎症反应，且作者最近的研究表明AB4作为一种新型PC抑制剂，可以与PC结合，抑制 LPS 驱动的炎症和氧化应激。基于以上发现，作者推测PC可能是AB4衍生物A3?6的直接目标。于是通过分子对接预测了两者的结合及结合位点，通过SPR、CETSA、DARTS证实了A3?6 与PC直接结合。免疫荧光分析显示A3?6的类似物A3?10（AB4-香豆素）可以进入THP-1细胞并与线粒体中的PC共定位，进一步证实了A3?6直接与PC结合。

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图6 A3?6 与丙酮酸羧化酶（PC）结合

6、A3?6的体外抗炎作用依赖于PC

A3?6可以特异性结合PC，但尚不清楚A3?6如何调节PC。作者用蛋白质印迹发现A3?6不影响PC 的蛋白质水平，进而酶活检测发现A3?6显著降低 LPS 诱导的 PC 活性。进一步研究发现A3?6 的抗炎作用与PC活性相关。这些结果表明PC在A3?6的抗炎作用中发挥着至关重要的作用。

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图7 A3?6的体外抗炎作用依赖于PC

7、PC 在体内介导A3?6的抗结肠炎作用

为了研究A3?6对DSS诱导的结肠炎的治疗效果是否依赖于体内PC，作者研究了DADA（一种PC激动剂，用于提高PC活性）对A3?6治疗小鼠的作用。发现A3?6 有效缓解了DAI评分的增加和结肠长度的缩短，然而，DADA的存在逆转了A3?6对结肠炎的作用。更重要的是，最低剂量的A3?6的治疗效果并不弱于AB4。

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图8体内评估A3?6的抗结肠炎作用

接着作者检测了促炎细胞因子IL-6水平，发现A3?6 对 IL-6 的释放表现出浓度依赖性抑制作用，DADA 显著逆转了A3?6 治疗小鼠的结肠促炎细胞因子 IL-6 水平，PC催化丙酮酸羧化为草酰乙酸，草酰乙酸是TCA循环中不可或缺的代谢物。作者发现A3?6也能影响体内 PC 活性和丙酮酸代谢，此外，A3?6抑制小鼠结肠组织中DSS诱导的IκBα降解和P65磷酸化，并且DADA有效逆转了A3?6的作用，这些结果进一步证实A3?6通过抑制PC/PA/NF-κB通路发挥抗炎作用。

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图9 PC在体内介导A3?6的抗结肠炎作用

总结

该研究通过结构修饰制备衍生物来增强AB4的抗炎活性和口服适用性，通过去除某些糖单元，所得AB4衍生物表现出降低的分子量和改善的水溶性。这种修饰有助于更容易地渗透细胞膜和线粒体内膜，增强其与位于线粒体基质中的PC（靶蛋白）的结合。此外，AB4衍生物的理化性质得到改善，可实现更好的吸收和更长的消除半衰期，可能导致治疗IBD所需的口服剂量减少。在这些衍生物中，A3?6被发现具有最高的抗炎功效。此外，在体外和体内研究了A3?6的抗炎机制和下调信号通路，发现A3?6是一种新型PC抑制剂，特异性地与PC结合，抑制PC活性，从而通过PC/NF-κB/NLRP3炎症小体轴减轻结肠炎。这些结果表明A3?6 是一种有前途的抗炎剂，能够通过靶向PC来减轻DSS诱导的结肠炎症。同时，PC已被确定为直接抗炎靶点，并可能作为治疗结肠炎的理想靶点。

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