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【金秋计划】槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠的保护作用及其机制

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

黄药子最早记载于唐代《千金月令》，为薯蓣科植物多年生草质缠绕藤本黄独Dioscorea bulbifera L.的干燥块茎，味苦，性寒，有小毒，入肺、肝经，可凉血、降火、消瘿、解毒[1]。黄药子临床常用于治疗多种癌症、炎性反应、甲状腺肿大等，其疗效确凿、临床使用价值颇高。随着黄药子临床应用的增加，其不良反应也逐渐显现，限制了其临床应用及疗效发挥。黄药子及其复方制剂所致不良反应包括肝损伤、肾毒性和胃肠道不适等，其中肝损伤最为严重[2-3]。临床表现为胃纳减退、乏力、上腹部饱胀、恶心及肝脾肿大和黄疸等，严重者会出现肝衰竭甚至死亡[4]。黄药子致肝损伤主要是由二萜内酯类化合物在肝脏蓄积诱发氧化应激反应导致[5]。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一种重要的核转录因子，可调节抗氧化蛋白的表达，减轻炎症及氧化应激，防止肝损伤[6]。Nrf2的激活是药物转运体发挥肝保护作用的重要机制。药物转运体是细胞膜上一类用于转运药物的蛋白，影响药物在肝脏中的吸收、分布、代谢和排泄，在大多数情况下，这些转运蛋白能促进药物和相应代谢物进出细胞[7]。黄药子可通过抑制药物转运体，增加二萜内酯类化合物及其代谢物在肝脏组织的蓄积，进而导致肝损伤的发生[8]。寻找有效的药物缓解其肝损伤对扩大其临床应用具有重要意义。
槲皮素为植物衍生的黄酮类化合物，广泛存在于山豆根、黄芩、槐花等中药中，其抗氧化、抗炎、抗癌作用尤为突出[9-11]。近年来，有研究显示槲皮素具有保肝活性，可减轻药物性肝损伤[12-13]。其肝保护作用可能与激活Nrf2-抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）通路、抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，进而增强下游抗氧化基因的表达、抑制炎症因子释放密切相关[14]。研究显示，槲皮素可通过上调多药耐药蛋白3（multi-drug resistance 3，MDR3）、有机阴离子转运多肽、多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein2，MRP2）表达改善胆汁淤积幼鼠肝功能，减轻肝组织病理变化[15]。本研究首次探究了槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠的肝保护作用，并基于抗炎、抗氧化及对药物转运体的调节作用探讨槲皮素改善黄药子致肝损伤的作用机制，为槲皮素作为护肝药物的药理学机制研究和增加黄药子临床应用提供理论参考。

1 材料
1.1 动物
SPF级昆明小鼠，体质量（20±2）g，购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK（川）2020-030。动物饲养于陕西中医药大学中药药理实验室，室温（23±3）℃，饲养动物期间给予正常饮水饮食。动物实验经陕西中医药大学伦理委员会批准（批准号SUCMDL20220304009）。
1.2 药品与试剂
黄药子（批号20220901）购自陕西兴盛德药业有限责任公司，经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为薯蓣科植物黄独D. bulbifera L.的干燥块茎；槲皮素（质量分数＞97%，批号BNU332）购自上海毕得医药科技股份有限公司；水飞蓟宾（质量分数＞98%，批号2020030301）购自盘锦天源药业有限公司；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（批号20230320）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒（批号20230314）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号20230313）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒（批号20230315）均购自南京建成生物工程研究所；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、IL-1β试剂盒（批号03/2023）均购自上海源桔生物科技中心；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号WLA004）、Nrf2抗体（批号R04112135）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体（批号R04262400）、NF-κB p65抗体（批号R03281273）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）抗体（批号R03281273）、核因子-κB抑制因子α（inhibitor of NF-κB-α，IκBα）抗体（批号R01041936）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号R04221556）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号R0411673）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抗体（批号N12272395）、β-actin抗体（批号R04251372）、Histone H3（批号R01040984）、HRP标记的羊抗兔IgG二抗（批号15A033）购自沈阳万类生物科技有限公司；MRP2抗体（批号386C9A09）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1（uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 1A1，Ugt1a1）抗体（批号6100001286）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。
1.3 仪器
BSA224S型分析电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；UPHW-II-90T型纯水仪（成都超纯科技有限公司）；1-15K型低温高速离心机（美国Sigma公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）；JT-12S型组织自动脱水机、JB-L5型石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；电泳仪（北京六一科技有限公司）。
2 方法
2.1 黄药子醇提物（ethanol extract of D. bulbifera，EEDB）的制备
取黄药子打碎成粗粉浸泡30 min后，加入6倍量75%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液于旋转蒸发仪蒸干至粉末状，?20 ℃保存，经HPLC测定EEDB中黄独素B质量分数为0.18%。
2.2 动物分组、造模及给药
动物适应性喂养3 d后，将48只小鼠随机分为对照组、模型组、水飞蓟宾（100 mg/kg）组和槲皮素高、中、低剂量（80、50、20 mg/kg）组，每组8只。对照组ig等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，其余各组小鼠ig相应药物及EEDB（2 g/kg），1次/d，连续30 d。
2.3 肝脏指数的测定
末次给药24 h后称定小鼠体质量，解剖后称取小鼠肝脏质量，计算肝脏指数。
肝脏指数＝肝湿质量/体质量
2.4 血浆生化指标检测
末次给药后，各组小鼠禁食不禁水24 h，眼球取血后置于抗凝离心管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上层血浆，置于?80 ℃冰箱备用。按照试剂盒说明书测定血浆中AST、ALT、SOD活性及MDA、IL-1β、IL-10、TNF-α水平。
2.5 肝组织病理学观察
用生理盐水冲洗肝脏组织表面后将其置入4%多聚甲醛固定液中，石蜡包埋后进行切片，脱蜡后进行苏木素-伊红（HE）染色，在显微镜下观察肝组织病理变化。
2.6 TUNEL染色检测肝组织细胞凋亡情况
按照试剂盒说明书操作，肝脏组织切片经脱蜡脱水后，采用蛋白酶K处理，通过DAB显色来显示凋亡细胞，苏木素复染并烘干后封片，使用光学显微镜观察凋亡细胞并拍照。
2.7 Western blotting检测肝脏组织相关蛋白表达
取各组小鼠肝脏组织，将混合的裂解液加入样品中，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，经BCA试剂盒测定蛋白含量，加入上样缓冲液混合，100 ℃加热15 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，采用ECL底物发光系统显像，然后扫描胶片并保存图像，采用Image J软件分析目标条带灰度值。
2.8 qRT-PCR检测肝脏组织药物转运体表达
采用Trizol法提取肝脏组织中总RNA，按照反转录试剂盒提供的说明进行cDNA合成，然后使用ExicyclerTM 96荧光定量试剂盒进行qRT-PCR分析。MRP2、P-gp、Ugt1a1引物序列见表1，肝组织中mRNA的表达水平采用2???Ct法分析。
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2.9 统计学分析
使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，数据结果以表示，若符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析；若不符合正态分布采用非参数检验。利用Graphpad prism软件制作柱状图。
3 结果
3.1 槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠体质量、肝脏指数及肝功能的影响
如图1所示，实验期间，每周记录小鼠体质量，实验第1周，与对照组比较，模型组体质量显著下降（P＜0.01）；实验第3、4周，与模型组比较，槲皮素各剂量组体质量显著升高（P＜0.01）。实验结束后测定肝脏指数及血浆生化指标，与对照组比较，模型组小鼠肝脏指数显著升高（P＜0.01），血浆中AST、ALT活性显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，水飞蓟宾组、槲皮素中、高剂量组小鼠肝脏指数及ALT活性均显著降低（P＜0.05、0.01），水飞蓟宾组和槲皮素各剂量组血浆AST活性均显著降低（P＜0.05、0.01），提示槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠的肝功能有明显改善作用。
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3.2 槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响
如图2所示，对照组小鼠肝组织细胞形态正结构正常，排列整齐，无炎性细胞浸润；模型组小鼠肝组织可见细胞坏并伴有炎症细胞浸润；与模型组比较，水飞蓟宾及槲皮素各剂量组给药后可明显改善肝细胞形态结构，可不同程度地减轻肝脏细胞坏死及炎性细胞浸润现象，提示槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠的肝组织细胞损伤具有保护作用。
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3.3槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠氧化应激的影响
如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠血浆SOD活性显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血浆SOD活性显著升高（P＜0.001），MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），提示槲皮素可抑制黄药子致肝损伤小鼠的氧化应激。
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3.4 槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠血浆炎症水平的影响
如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠血浆IL-10水平显著降低（P＜0.01），TNF-α及IL-1β水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，水飞蓟宾组及槲皮素高、中剂量组小鼠血浆IL-10水平显著升高（P＜0.01），IL-1β水平显著降低（P＜0.05），槲皮素各剂量组TNF-α水平显著降低（P＜0.01），提示槲皮素可黄药子致肝损伤小鼠炎症反应。
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3.5 槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响
如图3所示，与对照组比较，模型组明显观察到肝细胞凋亡；与模型组比较，各给药肝细胞凋亡均有所减少。如图4所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，水飞蓟宾及槲皮素高剂量组Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），水飞蓟宾及槲皮素高、中剂量组Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），提示槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠的肝细胞凋亡具有保护作用。
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3.6 槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠肝脏炎症相关蛋白及Nrf2、HO-1、MRP2、P-gp、Ugt1a1蛋白表达的影响
如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏p-NF-κB p65蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），IκB-α蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组p-NF-κB p65蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），IκB-α蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。
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如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏Nrf2、HO-1、MRP2、P-gp、Ugt1a1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，水飞蓟宾及槲皮素高剂量组Nrf2、P-gp、Ugt1a1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），水飞蓟宾及槲皮素高、中剂量组HO-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），槲皮素高剂量组MRP2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），提示槲皮素可通过Nrf2/NF-κB信号通路改善黄药子致小鼠肝损伤。
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3.7 槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠肝脏MRP2、P-gp、Ugt1a1基因表达的影响
如表4所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏MRP2、P-gp、Ugt1a1 mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，水飞蓟宾及槲皮素高、中剂量组小鼠肝脏MRP2、P-gp、Ugt1a1 mRNA表达水平均明显升高（P＜0.01）。
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4 讨论
本研究发现黄药子可导致小鼠氧化应激加重、释放炎症因子、诱导细胞凋亡，且黄药子还可抑制药物转运体的表达，干扰细胞新陈代谢，导致肝损伤的发生；而槲皮素干预后，小鼠细胞核Nrf2表达上调，NF-κB p65磷酸化及Bax凋亡途径过程被抑制，提示槲皮素可通过调控Nrf2、NF-κB及Bcl-2相关蛋白，减轻氧化应激、抑制炎症因子的表达及细胞凋亡，减轻黄药子诱导的小鼠肝损伤。且本研究结果首次证明了槲皮素可通过激活Nrf2及其下游药物转运对黄药子诱导的肝损伤产生治疗效果。ALT、AST是评价肝功能损伤的重要生物标志物，当肝细胞受损时，ALT和AST会大量释放到血液中，ALT和AST活性显著升高[16]。本研究结果显示，在连续ig EEDB后，小鼠血浆ALT、AST活性显著升高，在给予不同剂量槲皮素后，血浆中ALT、AST活性显著降低，肝脏组织学评估也进一步证明了槲皮素对黄药子致肝损伤小鼠具有保护作用。
氧化应激在肝损伤的发生过程中发挥了重要作用，当药物在机体内蓄积时可导致细胞内活性氧的过量释放并降低抗氧化能力，从而引起过氧化脂质的堆积，造成肝细胞氧化应激损伤[17]。Nrf2是一个关键的转录因子，可以调节抗氧化酶（如HO-1、SOD）的表达，减轻氧化应激。SOD是人体内重要的抗氧化酶，可抑制脂质过氧化；丙二醛是新陈代谢的最终产物，MDA的水平可以反映细胞氧化损伤的程度[18]。本研究结果显示，给予小鼠EEDB后，小鼠血浆中MDA水平增加，SOD活性降低，提示黄药子可导致机体氧化应激的产生，而槲皮素干预后，显著降低了MDA水平，增加了SOD活性；Western blotting结果显示，槲皮素可抑制EEDB诱导的Nrf2/HO-1蛋白表达的下降，提示槲皮素可通过减轻氧化损伤来改善黄药子引起的肝损伤。
NF-κB是一种与调节细胞炎症反应有关的重要转录因子。在生理条件下，NF-κB与细胞质中的IκBα结合，在接受外部刺激后，IκB降解，NF-κB亚基p65释放，磷酸化并迁移至细胞核，激活NF-κB通路。这一过程会诱导TNF-α、IL-6和γ干扰素等炎症因子的表达，并引起炎症反应[19]。而研究显示黄药子可诱导IκB蛋白减少及NF-κB p65的磷酸化及入核，诱发炎症反应[20]。本研究结果显示，在连续给予EEDB后，肝脏IκB蛋白表达显著减少，细胞核中p65的表达显著增加。而槲皮素逆转了这些变化。此外，槲皮素还抑制了EEDB引起的血清TNF-α和IL-1β水平的升高以及IL-10水平的降低，这些结果表明，槲皮素可通过抑制炎症相关蛋白表达减轻EEDB诱导的肝脏炎症。
黄药子诱发的肝损伤常伴随细胞凋亡的发生[21]，细胞凋亡是一个受特定基因高度调控的过程，Bcl-2和Bax是重要的凋亡蛋白，其中Bcl-2可抑制细胞凋亡，Bax可促进细胞凋亡[22]。在本研究中，观察到连续给予EEDB后会导致小鼠肝脏Bcl-2蛋白表达显著减少和Bax表达显著增加。然而，槲皮素逆转了这些变化，且TUNEL染色结果显示槲皮素缓解了EEDB在肝组织中诱导的细胞凋亡。上述结果表明，槲皮素可以通过调节Bax介导的细胞凋亡途径来防止黄药子引起的肝损伤。
Nrf2除发挥抗氧化作用外，还可调节药物转运体的表达，促进毒物的外排，减少其在肝脏的蓄积。药物转运体是一类促进药物跨细胞膜转运的蛋白质，影响药物在肝脏中的吸收、分布、代谢和排泄[23]。本研究发现，黄药子抑制了Nrf2的表达，下调了Ugt1a1、MRP2、P-gp的蛋白及mRNA的表达，导致肝细胞损伤，槲皮素高、中剂量组干预后可加速毒性物质的排出，减轻肝损伤。这些研究结果表明，槲皮素可通过增加Nrf2的表达和调节下游药物转运体来保护黄药子诱导的肝损伤。
综上，槲皮素对黄药子诱导的肝损伤有一定保护作用，其作用机制可能与其减轻炎症、抑制细胞凋亡、调控Nrf2及药物转运体的表达相关。

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