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采用高效液相色谱法对维生素C含量方法优化

szf0101

2024/09/18

中药/天然药检测

一、概述
维生素C又称作L-抗坏血酸，存在于许多植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是橘子、菠菜、莴笋等食品中含量极其丰富。身体严重缺乏的时候可会引起坏血病，表现为精神力差、烦躁、乏力等现象。《中国药典》收载的均为L（+）一抗坏血酸。因为维生素C的分子结构中具有与基共轭的烯一醇结构以及五元内酯环，所以使其性质极为活泼。还原性极强的烯二醇基，容易被氧化为具有二酮基结构的去氢维生素C，加氢又可以还原为维生素C。在碱性或强酸性的溶液中，去氢的维生素。又可以进一步水解，从而失去了活性。此性质常用于维生素C含量测定。
二、实验仪器、试剂及对照品
高效液相色谱仪（Agilent 1260 Ⅱ）、磷酸二氢钾（麦克林色谱级）、十六烷基三甲基溴化铵（麦克林HPLC≥98%）、甲醇（伊诺凯梯度级）、磷酸（阿拉丁色谱级）、偏磷酸（麦克林HPO₃≥38%）、L-半胱氨酸（麦克林色谱纯99%）、磷酸三钠（麦克林分析纯）、L（+）-抗坏血酸对照品（CATO，含量≥99.6%）、D（-）-抗坏血酸对照品（CATO，含量≥99.7%）
三、含量测定优化方法1：
采用《GB/T 5009.86-2016食品中抗坏血酸的测定》第一法高效液相色谱法
色谱柱：Supfex YS-C18 (4.6mm×250mm，5μm)（喆分）
一、流动相：磷酸二氢钾混合溶液（称取6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵，置烧杯中，加900ml水溶解，用磷酸调pH至2.6并转移至1000ml量瓶中，用水稀释至刻度）-甲醇（98:2）
运行时间：15min
柱温：25℃
流速：0.7ml/min
进样体积：20μl
检测波长：245nm
溶剂：20g/L偏磷酸溶液
空白溶液：取20mL溶剂于50mL离心管中，加入10mL 40g/L L-半胱氨酸溶液，用100g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.03（7.0~7.2），以200次/min振荡5min。再用磷酸调节pH至2.78（2.5~2.8），用水将试液全部转移至50mL量瓶中，并稀释至刻度。混匀后，过0.45μm水相滤膜后待测。
对照品贮备溶液：称取L（+）-抗坏血酸对照品和D（-）-抗坏血酸对照品各约10mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。（浓度约为1mg/ml）
对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液5ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。（浓度约为50μg/ml）
空白溶液图谱如下：

混合对照品溶液连续进样，图谱如下：
结论：由图谱可知，L+（-）抗坏血酸含量出峰时间在7.85～8.55 min，保留时间 RSD为3.03%,出峰时间出现严重漂移，分离度在1.16~1.60之间，随着进样时间的增长，分离度小于1.50，无法满足要求，影响测定结果准确性和可靠性，故重新优化方法。
四、含量测定优化方法2
参考文献《高效液相色谱法同时测定粳米中D（-）-抗坏血酸和L（+）-抗坏血酸的方法优化》：
流动相：0.1%磷酸-甲醇（98:2）
运行时间：15min
柱温：25℃
流速：0.7ml/min
进样体积：20μl
检测波长：245nm
溶剂：20g/L偏磷酸溶液
对照品贮备溶液：称取L（+）-抗坏血酸对照品和D（-）-抗坏血酸对照品各约10mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。（浓度约为1mg/ml）
对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液5ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。（浓度约为50μg/ml）
对照品溶液图谱如下：

结论：通过对含量方法优化比对，由图谱可知，L+（-）抗坏血酸含量出峰时间在7.99～8.07min之间，保留时间 RSD为0.38%，出峰时间稳定，分离度在2.29~2.33之间，均大于1.50，色谱分离效果良好，不对称度为0.90，小于2.0，理论板数为19400，结果较好，故将此色谱条件为最佳检测方法。

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