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解热中药共同物质基础及其作用靶点的研究

城头变幻大王骑

2024/09/18

中药/天然药检测

中药解表散寒治疗感冒发热已有数千年的历史，虽然药效明确，但其作用机制尚不清楚。前列腺素E2（PGE2）是炎症因子诱导发热的最终介质，在机体炎症和发热的病理进程中发挥了重要作用。在PGE2代谢合成过程中，游离的花生四烯酸（AA）被环氧合酶（COX1/2）催化生成前列腺素G2（PGG2），随后被还原为前列腺素H2（PGH2），将PGH2催化生成PGE2的前列腺素合酶分为诱导型合酶（mPGES1）与非诱导型合酶（PGES2、cPGES）。目前临床常用的解热镇痛抗炎药均为针对COX1/2的非甾体类抗炎药，虽然作用明显但其不良反应也较多，而中药，特别是退热草药，在有效控制发烧方面拥有完善的临床历史，在解热抗炎方面有独特的理论，且毒副作用较小。然而，其功效背后的具体机制仍不清楚。
对24种常用解热中药进行了系统筛选，发现发挥解热作用的关键药效成分，并采用化学生物学方法对其靶点机制进行了探究，研究发现含有α,β-不饱和醛药效团的挥发油成分，如肉桂中的桂皮醛、柴胡中的2,4-癸二烯醛、紫苏中的紫苏醛等通过与mPGES1-TM4螺旋（mPGES1-TM4）中的Ser139残基发生不可逆结合，共价调节mPGES1活性，有效抑制花生四烯酸代谢途径中前列腺素E2（PGE2，炎症因子引起发热的最终介质）的产生，从而发挥解热作用，为诠释辛温解表的科学内涵提供了一种新的见解，具有广阔的应用前景。

1. 对常用解热中药进行筛选，发现挥发油成分中含有α,β-不饱和醛酮的桂皮醛（CA）、紫苏醛（PA）、6-姜烯酚（SOL）和2，4-癸二烯醛（DAL）是发挥解热作用的关键药效成分。
2. 含有α,β-不饱和醛药效团的化合物可共价结合mPGES1-TM4的 Ser139残基，抑制脑血管内皮细胞中PGE2的合成，从而发挥解热作用。
3. 在AA-PGE2脂质代谢通路中，选择性抑制下游的mPGES1活性，有效减缓PGE2的过表达，可避免PGH2下游PGF2和PGD2，以及LOX下游12-HETE等炎性物质引发的毒副作用。
二、研究结果
1、含有α,β-不饱和基团的单体化合物抑制PGE2的产生
鉴于PGE2是发热的主要介质，作者在RAW 264.7细胞中研究了24种常用解热草药提取物对 PGE2 表达的抑制作用，进行PGE2拮抗活性筛选，发现桂枝、紫苏叶、生姜和柴胡对LPS诱导的PGE2 产生具有显著的抑制作用。为了进一步研究其功效，评估了上述提取物的不同极性层对PGE2表达的影响，发现挥发油的成分可显著减弱LPS诱导的PGE2表达。此外，四种主要成分（均有的α,β-不饱和醛结构为关键药效团），肉桂醛（CA）、紫苏醛（PA）、6-姜烯酚（SOL）和2,4-癸二烯醛（DAL），均源自这些草药来源的相应挥发油，可有效缓解LPS 热成像证实了体内诱导的高热。然而，缺乏α，β-不饱和基团的相应成分PPA、PAR、POL和DL并不影响PGE2表达。结果表明，α,β-不饱和基团可能在对抗 LPS 引起的发热方面发挥着至关重要的作用（图1）。
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图1 含有α,β-不饱和基团的单体化合物抑制PGE2的产生
2、mPGES1 被确定为CA的潜在靶点
肉桂醛（CA）作为肉桂挥发油的主要成分，因其优异的解热作用而被选择进行进一步研究，比较分析涉及肉桂酸（CAC）、肉桂醇（CALC）和苯甲基丙酮（BA）作为对照，其中α,β-不饱和醛基被修饰为羧基、羟基和酮基。只有CA和标记炔基的CA探针具有抑制PGE2表达的能力，表明α,β-不饱和醛基在发挥其解热活性方面发挥着关键作用。然后利用CA探针开展pulldown进行靶点筛选，将来自人类基因数据库的所有与退热过程相关的蛋白质以及捕获鉴定的蛋白质取交集得到四个潜在靶点（mPGES1、ANXA5、C1qBP和TRIM28），其中只有mPGES1与AA-PGE2途径相关。随后，mPGES1 被假设为潜在靶点，并通过蛋白质印迹得到证实。此外，CA探针捕获表明CA与PTGS2和COX2均没有相互作用，而这两种酶是 AA-PGE2 途径中的关键酶。共定位测试结果表明CA探针在RAW 264.7细胞中与mPGES1强烈融合，而敲除mPGES1会导致在mPGES1沉默的细胞中观察到减弱的合并黄色，表明mPGES1是CA解热的靶蛋白之一（图2）。
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图2 mPGES1 被确定为CA的潜在靶点
3、α,β-不饱和醛作为关键药效基团
为了证实α,β-不饱和醛作为抑制PGE2活性的关键药效团的重要性，选择另一种解热化合物2,4-癸二烯醛（DAL）来验证其构效关系。研究设计了α,β-不饱和双键还原类似物（DL）和DAL探针，DAL和DAL探针都通过抑制LPS诱导的 PGE2 表达表现出生物等效性，而DL则没有表现出这种抑制作用，同样使用SDS-PAGE和蛋白质印迹验证了DAL探针在AA-PGE2途径中捕获的蛋白质，这表明mPGES1可能是DAL的目标。与DAL探针预孵育后，凝胶成像分析显示DAL探针明显与mPGES1形成共价键。此外，共定位测试表明DAL探针与mPGES1在 RAW 264.7 细胞的细胞质中成功共定位。最后，CETSA证实CA或DAL与mPGES1的共价结合显著增强了其热稳定性。这些发现共同表明α,β-不饱和醛基在特异性靶向 mPGES1 发挥解热作用方面发挥着至关重要的作用（图3）。
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图3 α,β-不饱和醛作为关键药效基团
4、CA和DAL 与mPGES 1-TM4 Ser139处共价键合
mPGES1的亚基形成同源三聚体结构，由三个跨膜螺旋（TM1：Pro11–Lys41、TM2：Ser61–Ser90 和 TM3：Pro96–Gly119）组成，并具有额外的TM4螺旋跨残基（Pro124–His151）以完成四个跨膜螺旋结构。分子对接表明 CA 或 DAL 的 α, β-不饱和醛基与TM4中 Ser139 的羟基形成不可逆的结合。为了验证分子对接的预测，将CA或DAL与mPGES1蛋白的TM4 螺旋跨越残基一起孵育，并使用蛋白质谱解析鉴定结合产物，发现mPGES1中Ser139被CA标记，也能被也被 DAL 标记。此外，mPGES1-TM4 与其他解热分子PA和 SOL之间也存在不可逆键合。总之，只有α,β-不饱和醛基具有与mPGES1-TM4中的Ser139共价结合的能力（图4）。
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图4 CA和DAL与 mPGES 1-TM4 Ser139 处共价键合
5、CA特异性结合mPGES1的Ser139以抑制PGE2的产生
接着作者在HEK 293T细胞中进行mPGES1的敲低/回补。野生型mPGES1表达后，凝胶成像测定显示CA探针具有清晰的标记。然而，在回补 mPGES1-S139G 突变细胞时没有观察到该结果。通过在共定位测定过程中沉默RAW 264.7细胞中的 mPGES1，也证实了一致的发现。此外，观察结果与 mPGES1 抑制测试中 CA 对 PGE2 产生的影响一致。这些发现强烈表明残基 Ser139 是 mPGES1 上 CA 的唯一结合位点。先前的一项研究表明，敲低脑内皮血管系统中的COX2或mPGES1可显著改善LPS引起的小鼠发热，而沉默神经元或骨髓细胞中的COX2不会对小鼠体温产生显著影响。这些发现表明，脑血管内皮细胞合成的PGE2在介导体内发热反应中发挥着关键作用（图5）。
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图5 CA特异性结合mPGES1的Ser139以抑制PGE2的产生
6、CA和DAL与脑血管系统中的mPGES1结合
为了准确确定CA在脑内皮血管中的定位，将CA探针与分离的大鼠脑血管预孵育，从而实现mPGES1和CA探针之间共定位的可视化。凝胶内成像和蛋白质印迹进一步揭示，与未标记的CA相比，mPGES1与脑血管系统中的CA探针形成共价键。 DAL 探针预孵育组也获得了类似的结果。研究结果表明，α,β-不饱和醛化合物通过与 mPGES1 相互作用，与脑内皮血管系统表现出不可逆的结合（图6）。
7、CA抑制AA-PGE2途径关键代谢物的表达并发挥解热作用
为探讨含α,β-不饱和醛基化合物的体内解热机制，作者建立LPS诱导的SD大鼠发热模型。选择CA作为代表药物，而CAC和CALC作为对照组。使用肛门温度测量来评估对体温的解热作用。值得注意的是，与Mod组相比，CA 显著减弱了体温的变化。然而，CAC 和 CALC 均未表现出对大鼠体温升高有任何明显的抑制作用。随后，利用UPLC-Q-TOF/MS氧化脂质组学对大鼠脑组织中AA 代谢途径的变化进行定量分析，发现LPS刺激后，Mod 组中各种氧化脂质（包括 AA、PGG2、PGH2、PGE2 和 PGD2）的表达水平显著升高，而CA治疗通过调节AA-PGE2途径逆转了大鼠脑组织中AA、PGG2、PGH2和PGE2的上调，但对参与其他代谢途径的氧化脂质的表达没有产生显著影响。结果表明α,β-不饱和醛基靶向mPGES1调节AA-PGE2途径发挥其解热作用（图7）。

本研究阐明了CA和DAL与脑血管中的mPGES1共价结合的机制，通过抑制AA-PGE2通路并下调脑组织中PGE2的表达发挥解热作用。通过 α,β-不饱和醛靶向 mPGES1-TM4 代表了一种新颖的退热机制，为 mPGES1 抑制剂的开发提供了新的视角（图8）。

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