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高效液相色谱基础篇|关于氨基色谱柱使用的小知识

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2024/10/08

液相色谱（LC）

今天我们聊一款小众的色谱柱-氨基色谱柱，如果大家在实际使用过程中有遇到，可以参考。在高效液相色谱（HPLC）中，氨基色谱柱（NH₂柱）是一种常用于正相和亲水性相互作用液相色谱（HILIC）的色谱柱。它通常用于分离糖类、脂溶性维生素、核苷酸和水溶性维生素等物质。

01.氨基色谱柱的组成
1）色谱柱管：色谱柱管通常是由不锈钢制成管状结构，用于容纳填料。
2）填料：通常由硅胶或聚合物基质组成。在氨基色谱柱中，填料是在硅胶或聚合物基质上键合了氨基（-NH₂）官能团的球形颗粒。这些颗粒具有均匀的孔径分布，允许不同大小的分子进入孔隙内部。氨基官能团提供了亲水性相互作用和弱阴离子交换的特性，适合于分离极性化合物。
02.氨基色谱柱的分离机制
1）HILIC模式：在这种模式下，氨基色谱柱用作亲水性相互作用色谱柱，适用于糖类、糖醇等化合物的分析。流动相通常是水和有机溶剂（如乙腈）的混合物，通过调整流动相中水和有机溶剂的比例，可以控制分析物的保留行为。在HILIC模式下，氨基色谱柱的氨基提供了与极性化合物相互作用的位点，通过氢键和偶极-偶极相互作用实现保留。
2）弱阴离子交换模式：在酸性流动相条件下，填料表面带正电荷，适用于水溶性维生素或核苷酸类的分析。这种模式下，氨基色谱柱的氨基官能团可以作为弱阴离子交换位点，通过离子交换作用保留带负电荷的分析物。
3）正相模式：氨基色谱柱也可以在正相色谱中使用，分析酸性物质、烃类化合物、维生素A和D等。在正相色谱中，通常使用非极性流动相，氨基柱的氨基官能团可以与分析物形成氢键或其他极性相互作用。（较少）

03.氨基色谱柱使用的注意事项
1）使用前：
a. 检查色谱柱包装和标签：确保色谱柱没有物理损伤，确认色谱柱的规格和填料类型符合实验需求。
b. 阅读说明书：仔细阅读色谱柱的使用说明书，了解色谱柱的pH稳定性范围、最大操作压力等参数。
c. 系统冲洗：使用适当的溶剂冲洗色谱系统，确保系统中没有气泡和污染物。
d. 色谱柱平衡：柱子需要用流动相平衡，直到基线稳定。HILIC模式下，通常需要平衡4～5小时。（有些甚至过夜平衡）注：如果上一个试验是无机盐的流动相试验，需要对仪器进行充分的冲洗，怕产生盐析；同理，如果是做了氨基柱的试验换成无机盐试验，也是要充分冲洗。
2）使用中：
a. 流动相组成：确保流动相组成适合分析物和色谱柱，严格控制pH值在色谱柱的允许范围内（通常是pH 2-8）。注：如果是是无机盐与有机相的混合流动相，要注意加入的先后顺序，可能会有结晶析出
b. 样品溶解性：样品应在流动相中完全溶解，避免在柱上沉淀。
c. 流速控制：设置合适的流速，以获得最佳分离效果。
d. 样品负载：避免超载，以保持色谱峰形和分辨率。
e. 温度控制：根据需要调整柱温，以优化分离效果。
3）使用后：

a. 柱子清洗：分析完成后，使用适当的溶剂冲洗色谱柱，以去除可能的污染物。

注：如果是含有无机盐-有机相的流动相

这个冲洗要先含有较多水的有机相进行冲洗（如95%水-乙腈），除盐→然后再转到高有机相冲洗（如95%乙腈水），除杂→再过渡置换成保存溶液

一般不要使用100%水冲洗色谱柱，氨基会水解。

b. 柱子保存：短期内如果不用，可以用与流动相相同组成的溶剂保存。长期不用，建议用色谱柱出厂时的保存液（如100%异丙醇）保存。

c. 记录使用情况：记录色谱柱的使用情况，包括分析的样品、使用条件和色谱柱表现，以便于追踪柱效和寿命。

04.氨基色谱柱使用的局限性
1）pH值限制：氨基色谱柱的氨基官能团对pH值较为敏感，通常推荐的pH值使用范围是2-8。超出这个范围可能会加速氨基官能团的水解，从而缩短色谱柱的使用寿命。
2）溶剂兼容性：在反相条件下使用时，需要注意流动相中水的比例和pH值，因为高比例的水和极端的pH值可能导致官能团水解。
3）样品极性：氨基色谱柱对极性化合物的分离效果较好，但对非极性化合物的分离能力相对较弱。
4）样品负载：样品浓度和负载量不宜过高，以避免超载现象，导致色谱峰形变宽和分辨率下降。
5）温度敏感性：虽然适当的温度升高可以提高某些极性化合物的溶解度和分离效率，但过高的温度可能会加速色谱柱的老化。
6）缓冲盐类：如果流动相中含有缓冲盐，需要特别注意在分析前后使用不含盐的流动相进行适当的过渡，以避免盐类在柱内的析出。
7）保存溶剂：新购买的氨基柱的保存溶剂可能与使用的流动相不互溶（可能出厂保存在正相溶剂中，一般要用异丙醇置换），需要使用适当的溶剂进行过渡。

总结一下：氨基色谱柱（NH₂柱）在高效液相色谱（HPLC）中的角色有点像个分类专家，它通过分子的极性来区分它们。这种色谱柱是由不锈钢管和特殊填料构成的，填料上的氨基官能团能够与极性分子亲和，帮助我们把不同的分子分开。使用时，得注意几点：首先，pH值要控制在2到8之间，这样氨基官能团才能稳定工作。其次，样品要在流动相中溶解得好，免得在柱子里堵路。流速和温度也要适当调整，以保证分离效果。用完以后，别忘了用合适的溶剂冲洗，短期保存可以用流动相，长期的话最好用出厂时的保存液。氨基色谱柱虽然对极性分子分离有一手，但对非极性分子就不太灵了，而且它的分辨率和灵敏度可能不如其他类型的色谱柱。所以，如果你的样品极性很强，氨基色谱柱是个好选择，但要是分子大小差不多，或者你需要高分辨率和灵敏度，那就可能得考虑其他色谱柱了。总的来说，氨基色谱柱是个实用的工具，特别适合分析那些对环境条件敏感的极性分子。

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