供货周期: | 一周 |
品牌: | |
规格: | 250U—1000U |
货号: | EN1011 |
CAS号: |
概述
Long Taq DNA Polymerase是华因康Taq DNA Polymerase和一种具有3→5校对活性的耐热DNA聚合酶按照特定比例混合而成。该酶与普通的Taq DNA Polymerase相比,它具有保真性高、扩增效率高、高效扩增GC Rich的复杂片段(配合2×HYK GC Buffer,with 4mM MgSO4)的优良性能。Long Taq DNA Polymerase扩增产物可用于TA克隆,如需提高克隆效率,建议先纯化PCR产物,加A后再进行TA克隆。
应用特点
1.高效特异PCR扩增、Long Range PCR、TA克隆、GC Rich片段扩增、AT Rich片段扩增。
2.LongTaq DNA Polymerase的保真性是普通Taq DNA Polymerase的3倍以上。
3.病毒模板可扩增至30kb,人基因组可有效扩增17.6kb片段(beta globin);配合2×HYK GC Buffer(with 4mM MgSO4)可高效扩增GC Rich片段。
4.扩增速率:1kb/min。
活性单位定义
1单位(U)Long Taq DNA Polymerase活力定义为在72℃条件下,30min内,以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,催化掺入10nmol 脱氧核苷酸成为酸不溶性物质所需的酶量。
保存
-20°C低温保存。
抑制和失活
失活:酚/氯仿抽提。
保存缓冲液
20mMTris-HCl(PH7.4 25℃)、100mMKCl、0.1mMEDTA、0.1%NP-40(v/v)、0.1% Tween-20 (v/v)、1mMDTT和50 %甘油(v/v)。
反应缓冲液
(1)5×Long Taq Buffer(with 10mM MgSO4)
300mMTris-SO4(PH7.4 25℃)、100mM(NH4)2SO4、10mMMgSO4、0.3%NP-40(v/v)、0.25%Tween-20 (v/v)T,Stabilizer。
(2)2×HYK GCBuffer(with 4mM MgSO4)
120mMTris-SO4(PH9.0 25℃)、40mM(NH4)2SO4、4mMMgSO4、0.15%NP-40(v/v)、0.12%Tween-20 (v/v)T,其他成分。
使用说明
1.Long Range PCR(>10kb)
组分 | 终浓度 |
ddH2O(nuclease-free) | 变量 |
5×Long Taq Buffer(with10mM MgSO4) | 1× |
dNTP Mix | 500µM each |
Forward primer | 0.4µM |
Reverse primer | 0.4µM |
Template DNA | 50pg~1µg |
Long Taq DNA Polymerase(5U/μl) | 1.25U~2.5U |
总体积 | 50µl |
组分 | 终浓度 |
ddH2O(nuclease-free) | 变量 |
2×HYK GC Buffer(with 4mM MgSO4) | 1× |
dNTP Mix | 200µM each |
Forward primer | 0.2µM |
Reverse primer | 0.2µM |
Template DNA | 50pg~1µg |
Long Taq DNA Polymerase(5U/μl) | 1.25U~2.5U |
总体积 | 50µl |
注意事项:① 使用2×HYK GC Buffer(with 4mM MgSO4)进行PCR扩增时,建议使用Tm值较高的引物;引物最好设计在30mer左右;
② PCR的反应体系请在冰上配制,然后置于预热至变性温度下的PCR反应仪上进行PCR反应,可增强PCR扩增的特异性。
一般情况下,若5×Long Taq Buffer(with10mM MgSO4)扩增不成功,可尝试用2×HYK GC Buffer(with 4mM MgSO4)扩增。
质量控制
纯度检测:经SDS-PAGE检测纯度大于95%。
核酸内切酶检测:10U Long Taq DNA Polymerase与500ng λDNA在1×Long Taq buffer中37℃共同孵育16h,0.8%琼脂糖电泳检测,DNA没有出现降解和被切断,表示通过该项检测。
核酸外切酶检测:10U Long Taq DNA Polymerase与200ng 50 bp ssDNA在1×Long Taq buffer中37℃共同孵育16h,15%变性PAGE胶电泳检测,DNA没有出现降解,表示通过该项检测。
大肠杆菌DNA污染检测:
PCR 产物:544 bp
Forward primer:5-GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3
Reverse primer:5-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-3
PCR程序:94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有544bp产物出现,表明通过该项检测。
质粒污染检测:
T7 Promoter Primer:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3
T7 terminator Primer:5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3
PCR程序:94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min.
0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现,表明通过该项检测。
支原体污染检测:
PCR产物:717 bp
GPO-1:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3
MGSO:5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3
PCR程序:94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min.
0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现,表明通过该项检测。
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