| 供货周期： | 一周 |
| 品牌： | |
| 规格： | 200U—1000U |
| 货号： | EN1001 |
| CAS号： |
概述
Klenow Fragment(3→5 exo-)是大肠杆菌DNA聚合酶I的蛋白水解产物，具有5→3的DNA聚合酶活性，但失去了5→3外切核酸酶活性。该酶经突变(D355A, E357A) 去除了其3→5的外切核酸酶活性，所以不适用生成平末端的反应。
应用
1.随机引物法DNA合成。
2.双链DNA 5’突出(5’ overhang)末端的标记。
3.双脱氧法DNA序列测定（Sanger法）。
来源
从带有编码DNA聚合酶I基因的E.coli polA菌株中提取，并利用基因重组技术，使用E.coli表达和纯化Klenow Fragment(3→5 exo-)。
活性单位定义
在37°C条件下，30min内能使10nmol的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。
贮存条件
25mMTris-HCl (PH 7.4)，0.1mMEDTA，1mMDTT, 50%甘油, -20℃贮存。
10×反应缓冲液
100mMTris-HCl（PH 7.9 25℃）, 500mMNaCl ,100mMMgCl2 , 10mMDTT。反应时需要加入dNTP(不随酶提供)。
热失活
75°C20min。
活性抑制剂
金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)。
纯度
考马斯蓝染色SDS-PAGE检测纯度大于90％，并无核酸内切酶、外切酶及RNase污染。
应用
一.随机引物法进行DNA标记
第一步：混合下面各种反应物。
| DNA | 100ng |
| 10×反应缓冲液 | 5μl |
| 125μM随机引物 | 10μl |
| 无核酸酶的去离子水 | 补至40μl |
| 3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled) | 4μl |
| [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol) | 1.85MBq (50μCi) |
| Klenow Fragment(3→5 exo-) | 5U |
| 无核酸酶的去离子水 | 补至50μl |
| DNA Designed | 0.1－4μg |
| 10×随机引物(1.5mg/ml) | 1μl |
| 10×反应缓冲液 | 2μl |
|
[α-32P]-dNTP, ~15-30TBq/mmol (400-800Ci/mmol) 或[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol) |
0.74 MBq(20μCi) 2.96 MBq(80μCi) |
| 3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled) | 2μl |
| Klenow Fragment(3→5 exo-) | 1U |
| 无核酸酶的去离子水 | 补至20μl |
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