方法开发

方法开发成功的第一步——选好柱子色谱分析中色谱柱的选择是方法开发过程中重要的一步，对于分离效率具有重大影响。一旦选错了色谱柱，将会无谓地延长和消耗方法开发和优化的时间、资金和精力。许多实验室常常限制色谱柱的选用，常会将其方法建立在一种主流的色谱柱化学（例如惯用的端基封口的C18 色谱柱）上。然而，还有更多改善后的固定相、填料基质可供方法开发时筛查选择性和提高分离之用。ACE方法开发工具包，为方法开发智能解决方案 l 性能优越且独特，规格齐全l 不同机制之间相互作用，显著增加选择性和分离度l 固定相的差异，直接节约方法重建的时间成本l 专业高端，价格便宜，节约经费样品： 1） 甲硝唑，2) 4-羟基苯甲酸，3) 3-羟基苯甲酸, 4) 苯甲醇, 5) 苯甲酸, 6) 杨梅素, 7) 对甲酚, 8) 普萘洛尔, 9) 对羟苯甲酸乙酯, 10) 呋塞米, 11) 苯甲醚, 12) 1,3,5-三硝基苯, 13) 甲苯, 14) 尼美舒利, 15) 甲芬那酸, 16) 1,2,3-三氯苯ACE高级方法开发工具包(一)l 包含ACEC18，C18 ACE-AR和ACE C18-PFP固定相l 适合零起点的常规方法开发l 包含从微孔（0.5毫米）到通用分析（4.6毫米）的尺寸l 特别推荐用于含有芳香环的化合物 （1）ACE-C18 l 高纯、超惰性碱灭活硅胶，可避免硅羟基与分析物的次级作用。l 在 酸性、碱性和中性化合物高效极佳分离；l 与其它品牌色谱柱相比，更适用于碱性物质分离分析相似：SunFire C18 、Luna C18(2)、Zorbax XDB、Hypersil GOLD ODS等 （2）ACE-C18 ARl C18、苯基(Ph)两种键合相的特性融入单一键合相中，结合两种键合相的优势，形成独特的选择性。耐受100%水相。l 应用于方法筛选开发中单独C18或Ph无法实现的复杂混合物分离和具有吸电子基团的异构体分离。如：卤素，硝基，酮，酯和酸、芳香族烃、类固醇、含硫化合物 （3）ACE-C18 PFP l C18、五氟苯(PFP)两种键合相的特性融入单一键合相中，结合两种键合相的优势，形成独特的选择性。耐受100%水相。l 应用于方法筛选开发中单独C18或PFP无法实现的复杂混合物分离和具有供电子基团的异构体分离。如：酚类，芳族醚和胺，芳香烃、类固醇、紫杉烷类化合物样品：1) 4-乙酰氨基苯酚, 2) 4-氨基苯甲酸, 3）4-羟基苯甲酸, 4）咖啡因, 5）2-乙酰氨基苯酚, 6）3-羟基苯甲酸, 7）水杨酰胺, 8）N-乙酰苯胺, 9）苯酚, 10）乙酰水杨酸, 11）苯甲酸, 12）山梨酸, 13）水杨酸, 14）phenylacetin, 15）水杨醛样品：1）1,2,3-三甲氧基苯 2）1,2,4-三甲氧基苯 3）1,2-二甲氧基苯 4）1,4-二甲氧基苯5）甲氧基苯 6）1,3-二甲氧基苯 7）1,3,5-三甲氧基苯 8）中性分子ACE扩展方法开发工具包（二）l 包含ACESuperC18，ACE CN-ES和ACEC18-Amide固定相l 使用ACESuperC18可根据目标物在低，中，高pH值的选择性变化进行方法筛选l 包含从微孔（0.5毫米）到通用分析（4.6毫米）的尺寸l ACEC18-Amide和ACE CN-ES阶段都提供了另一种选择，特别是对于极性分子 （1）ACE Super C18 l 专利的EBT固定相键合封端技术l 中低极性选择和高PH耐受性（1.5-11.5）l 高比例缓冲盐条件下的LC/MS实验，稳定性极佳l 多种规格符合UPLC和HPLC要求且均达到高效相似：Xbridge 、Xttra、EcosilExtend、MG Ⅱ等 （2）ACE CN-ES l 采用高纯惰性硅胶表面与CN基间扩展长的烷基链键和方式，增加了C18的稳定性和疏水性。l 较传统短烷基链接的氰基柱有更耐水（100%）、更稳定、更长柱寿命。l 多应用于强极性、极性、非极性的混合物的共同分离、三键或双键化合物分析、正反两相兼容；方法筛选开发中传统短链CN无法实现的复杂混合物分离。 （3）ACE C18-Amide ? 超长烷烃与C18链间嵌入酰胺基团，提高极性，酸性，碱性和酚类化合物的分离，耐受100%纯水相，扩展烷烃链技术还提供了更长的柱寿命。相似：symmtrysheild C18、Zorbax Bouns、sigmaDiscoveryRP Amide C16 、Ecosil EPS样品： 1）尼扎替丁 2）沙丁胺醇 3）阿米洛利 4）N- acetylprocainamide 5）喹喔啉 6）对羟基苯甲酸甲酯 7）对-甲酚 8）利血平 9）胡椒素 10）甲苯 11）非洛地平样品：1）间苯二酚2）邻苯二酚3）2-甲基间苯二酚4）4-甲基儿茶酚5）3-甲基儿茶酚6）4-硝基儿茶酚样品：1）甲硝唑2）苄醇3）双氢4）香草醛5）对羟基苯甲酸甲酯6）1,2-二硝基苯ACE UltraCore方法开发工具包（三）l 包含核壳型填料ACEUltraCore SuperC18和SuperPhenylHexyl优异封端技术固定相l 利用在低，中，高pH值的选择性变化进行方法筛选l 包含从微孔（0.5毫米）到通用分析（4.6毫米）的尺寸l 超惰性核壳粒子和封装键合技术（EBT?）提供优异的峰形 ACE UltraCore（核-壳） ????l 高效率2.5μ m和5μ m实心核颗粒，快速分析。l两种选择性互补的键合相SuperC18和Super PhenylHexyl（苯基-已基），为方法开发提供了便捷。l超惰性硅胶表面采用独特的封装键合技术（EBT），高PH稳定性（PH1.5-11.5）。l 细小分散的硅胶颗粒附着在超强度实芯核表现出超高的柱效和低的背景压力，实现普通HPLC上完美的UHPLC效率和性能。相似：Aglient Proshell ，waters CORTECS? 、Thermo Scientific Accucore、Kinetex等 人参皂苷分离分析对比图：样品：1）吡哆醇 2）对氨基苯甲酸 3）泛酸 4）叶酸 5）d-生物素 6）氰钴胺素 7）核黄素ACE生物分析300?方法开发工具包（四）l 包含ACE C18-300，ACE C4-300和ACE苯基-300固定相l 适合零起点蛋白质和多肽的方法开发l 包含从微孔（0.5毫米）到通用分析（4.6毫米）的尺寸l 超惰性300?阶段提供优异的峰形和重现性 ACE 300? 系列超惰性HPLC柱 l 采用了先进的技术制造，几乎消除硅醇基和金属污染对肽，蛋白质、其他高分子量的生物大分子分离的负面影响l 该系列的超惰性特性体现在如流动相中仅使用低至0.005％的TFA仍能保持很好的峰对称度；而市面上其他品牌的300?系列大多使用0.01％TFA就表现出了很差的峰型，从而间接降低了灵敏度的运行能力。样品：1）甘氨酸 - 酪氨酸 2）催产素 3）血管紧张素Ⅱ 4）神经降压素ACE 分 析 方 法 包 推 广 大 促—— 为方法开发提供智能的解决方案惊喜一 高质低价，让实验结果给你大吃一惊！！！一套超级优惠的方法包（相同规格新颖固定相的2支或3支高性能多填料类型色谱柱），只需1支ACE色谱柱的市场价格！！ 惊喜二 丰富好礼，价值500元大礼任你选！！！即日起凡成功订购一套并成功关注广州绿百草微信公众号的客户，即送价值500元的京东礼品~ ~ 多定多得，数量有限！还等什么？赶紧联系 广州绿百草 咨询吧！活动时间：2015年11月1日- 2015年12月31日 注：本活动最终解释权归广州绿百草生物科技有限公司所有英国ACE色谱技术有限公司 致力于解决色谱应用领域的挑战而开发各系列产品，以满足色谱分析工作的要求。极限的性能、合理价格的产品以及优质的技术服务，在世界范围内的制药、生物技术公司、 大学、医院、科研机 构、政府机构以及环境与工业过程质量控制行业中获得了无与伦比的声誉。更多英国ACE的产品信息、应用实例及资料，请联系ACE一级代理商 —— 广州绿百草生物科技有限公司

岛津公司近日推出UHPLC用Nexera方法开发系统，该方法开发系统用于缩短分析方法开发过程并实现自动化，适用于广泛的分析领域，如药物发现、合成和药物生产及质量控制中。Nexera方法开发系统为实现分析工作者的提升方法开发速度和效率的愿望提供了新的利器。 该系统利用最多16种流动相和6支色谱柱构成96种方法组合，自动获得数据。这使得在缩短方法开发总体时间的同时，可以开展全面的分析条件摸索。该系统包括专用软件Method Scouting Solution以及专用管路组件(Nexera Method Scouting System启动包) 。利用该软件，基于不同色谱柱和流动相的选择及组合，可以轻松地配置分析方法开发流程。此外， FCV-34AH六位七通高压切换阀最高耐压达到100MPa，使得方法开发可以在超高压条件下进行。 Main Window for Method Scouting Solution UHPLC用Nexera方法开发系统具有如下特点： 1) 实现自动化并缩短方法开发过程 该系统可在方法开发过程中自动选择流动相和色谱柱。2台泵分别安装有4路溶剂选择阀，从而可以从最多16种组合中自动筛选流动相。此外，通过FCV-34AH六位七通高压流路切换阀，可以实现六柱切换。包括流动相和色谱柱在内，实现最多96种分析方法的自动筛选。并且，在完成流动相和色谱柱的优化之后，可以进行梯度优化。利用该系统，从方法改变时的流动相排气，到平衡色谱柱和基线稳定，都可以自动完成。通过自动设置方法开发序列，结合仪器彻夜连续自动运行，可以显著缩短分析周期。 2)利用Method Scouting Solution 简化操作 专用的Method Scouting Solution 软件提供图形化用户界面，支持方法开发过程Page 3自动化。该软件在主窗口中提供了一个方法开发用色谱柱和流动相的可视化配置环境。此外，与LabSolutions 软件无缝连接，可以自动创建方法开发序列，减少大量创建方法、批处理表时所需的繁琐工作。方法开发中所使用的色谱柱和流动相储存在数据库中进行管理，因此，在方法开发过程中，通过软件主窗口可以轻松的配置色谱柱和流动相。 3) 单一系统兼顾快速分析和常规分析 该系统基于Nexera 超高效液相色谱系统搭建而成，从常规分析方法到快速分析方法开发，可以提供广泛支持。即使在常规分析方法开发中，该系统可以使用快速分析条件进行方法摸索，从而缩短分析方法开发时间。 4) 轻松浏览分析结果 利用LabSolutions 数据浏览器功能，分析序列结果可以排列显示，方便比较不同条件下的分离效果。另外，利用Class-Agent Report 软件，系统可以显示并自动输出分离度评价值报告，该评价值基于不同分析条件下分析结果中的峰分离度数据，每一个分析条件都可以获得准确、客观的评价。 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有12个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn。

双十一结束小奥的购物车都清空了没法儿给你抄了我借ELISA实践笔记给你抄快到期末/年底了实验汪们可要抓紧搬砖咯前面三份笔记拉到文末看哦以下，可都是尖货儿哟！??Part 1 —— 前 言 | ELISA方法用于杂交瘤和噬菌体展示筛选是最为广泛的高通量的抗体发现的筛选方法，其实质是亲和力测定方法的一种变种，其目的是需要建立ELISA信号值和样品亲和力大小之间的正相关性。相对于采用ELISA进行抗体的亲和力测定方法，用于杂交瘤和噬菌体展示筛选的ELISA方法有以下难点：1.待测样本极具多样性，且单一样品通常也是混合物，有很大的可能存在非特异吸附；2.不同的待测样品之间可能存在较大的浓度差异，浓度的大小和亲和力的大小均会对检测结果产生影响。在进行杂交瘤和噬菌体展示筛选方法开发时，需要选择合适的条件使信号值主要能够表征亲和力的大小而一定程度上忽略浓度差异造成的影响。本文是ELISA定量测定方法开发和亲和力测定方法开发的进阶版本，配体受体反应的基本原理解析，和两种应用的差异性区分是进行ELISA筛选方法的开发的基础。 Part 2 - 原理解析 - ELISA信号值和亲和力大小的关系 无论是进行杂交瘤的筛选还是噬菌体展示的筛选，其化学原理的实质是抗体和抗原可逆的相互作用，John McCafferty在Phage Display of Peptides and Proteins A Laboratory Manual一书的第七章节Phage Display：Factors Affecting Panning Efficiency中对可逆反应的数学原理有过理论的推导和实验的验证，简而概之可以用下面的公式进行描述：Abinput代表可逆反应中抗体的加入量，Aginput 代表可逆反应中抗原的加入量，Kd代表Ab和Ag的亲和力大小。由公式可知，当反应完成时，形成的抗原抗体偶联物占抗体的加入量的比值（proportion bound），是一个与抗原的加入量和亲和力大小这两个参数相关的特征函数。具体在ELISA测定过程中当抗体的加入量是恒定值时，proportion bound可以用检测的信号值来等价表示，在ELISA反应中抗原的加入量和Kd将决定信号的大小。相同浓度的抗体，因为亲和力不一样，在同一抗原浓度下其proportion bound的比例也不一样，用具体的图形演示如下图：红色实线是亲和力为1nM的抗体Ab1随抗原浓度变化其proportion bound的函数曲线，蓝色实线是亲和力为10nM的抗体Ab2随抗原浓度变化其proportion bound的函数曲线，绿色虚线为在相同抗原浓度下，Ab1/ Ab2 proportion bound的比值。在抗原浓度为10nM的条件下，90%的Ab1(Kd=1nM)和50%的Ab2(Kd=10nM)能够形成抗体抗原偶联物，作为ELISA检测的信号值，Ab1，Ab2亲和力10倍的差异反应到ELISA信号值上1.8倍的信号差异；在抗原浓度为1nM的条件下，50%的Ab1(Kd=1nM)和9.1%的Ab2(Kd=10nM)能够形成抗体抗原偶联物，作为ELISA检测的信号值，Ab1，Ab2亲和力10倍的差异反应到ELISA信号值上5.5倍的信号差异；在加入的抗体浓度是相同的情况下，加入反应的抗原的浓度越少，ELISA信号比值的差异和抗体亲和力比值的差异更具相关性。抗原的浓度决定了ELISA筛选方法的选择性！以上是关于杂交瘤和噬菌体展示筛选理论状态的推导，也是ELISA筛选结果出来了做出客观解读的理论依据，在实际的筛选应用过程中由于不同的待测抗体样品之间可能存在较大的浓度差异。在抗原浓度较高的情况下ELISA信号差异很多情况下由于抗体样品的浓度差异导致的，ELISA信号值对于亲和力大小不具有选择性；只有在抗原浓度较低时，信号值主要能够表征抗体亲和力的大小而一定程度上忽略浓度差异造成的影响，而在ELISA方法开发时当抗原浓度较低时，相对于抗原浓度较高时，其ELISA信号值要弱很多，提升ELISA方法信号的灵敏度，如何通过优化酶联抗体的浓度，挑选显色液和选择显色时间以增强ELISA检测的信号值是一个有区分度的ELISA筛选方法的关键。当ELISA检测的信号值得到提升时，由于筛选样品复杂性，往往其背景信号也会极大的提升，如何通过封闭液，酶标板材等降低背景信号值，得到好的信噪比是一个高质量的ELISA筛选方法的另一个关键。Part 3 - 实例分享 - ELISA用于噬菌体展示筛选布 局——————(Note 1)一 般 操 作 流 程1.酶标板的制备取浓度为100 ug/ml抗原，室温溶解，混匀用包被液按如下步骤稀释至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加样布局表加入100ml/孔，分别加入酶标板条中 (Note 2)，其中加入包被液做包被抗体的空白对照，2-8℃过夜。2.用洗涤液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封闭液(Note 3)室温封闭1小时；洗涤液洗板3次，拍干待用；3.取出包含有阴性对照和阳性对照过夜孵育制备含有噬菌体的深孔96孔板，在奥豪斯高速离心机中2000g离心15min，取上清，稀释10倍，一一对应加入包被好酶标板中。(Note 4)4.放入奥豪斯微孔板振荡器内 (如ISLDMPHDG- 30391935)，设置37℃、600rpm振荡1小时； 5.用洗涤液洗板3次，拍干；6.抗M13 p8酶联抗体稀释到合适的浓度（Note 5），在漩涡混合器上（如VXMNFS-30392112）混匀，100ul/孔。7.放入微孔板振荡器内，设置37℃、600rpm振荡1小时； 8.用洗涤液洗板4次，拍干；9.取酶联抗体对应的TMB显色液，临用前20分钟拿出平衡到室温，在漩涡混合器上混匀；（Note 6）10.使用8道排枪以100 ml/孔加入TMB显色液；11.显色液室温避光放置10-30分钟 （Note 7）；12.使用8道排枪以100ml/孔加入终止液终止反应；13.用酶标仪测定信号值；14.结果分析（Note 8）。Note1：由于不同的噬菌体样品有不同的亲疏水性，其对酶标板材的非特异吸附强度不一样，做一块没有抗原包被的阴性对照板是十分有必要的。Positive和Negtive是和样品有同样噬菌体制备过程，Positive Stock为早已经制备好的分装保存的阳性噬菌体，前者目的是监控在不同时间内噬菌体样品制备过程的差异，后者是监控在不同时间内ELISA检测操作的差异。Note2：在包被过程中，建议选择疏水性酶标板材（polysorp）,这样可以极大的减少背景信号值，提高整个方法的信噪比。在实验初期包被的抗原浓度需要少量0.2-1ug/ml，然后根据不同包被条件下同一样品信号大小来进行判断优化。一个已知亲和力的展示阳性抗体的噬菌体是十分有必要的，根据该阳性展示噬菌体样品的信号值来确定最终筛选过程中抗原的包被浓度。抗原直接包被酶标板材上会屏蔽部分结合位点，造成部分假阴性的结果，如果条件允许可采用生物素化抗原，首先5ug/ml的链霉亲和素包板，然后加入0.05-0.2 ug/ml不等的生物素化抗原。抗原直接包被和间接包被其效率不太一样，采用间接包被可适当降低生物素化抗原的包被浓度。Note3：在有生物素化抗原参与的ELISA实验中，不要加入含脱脂奶粉的封闭剂，脱脂奶粉含有微量生物素，会干扰整个检测体系。Note4：噬菌体上清液的稀释比例，可提前根据阳性噬菌体样品做好稀释预实验进行确定。Note5：应选择抗噬菌体的P8蛋白的酶联抗体，噬菌体有2000个以上的P8蛋白，适当的增加酶联抗体的浓度可以提高方法的灵敏程度，笔者曾增加5倍的酶联浓度得到了3倍的信号提升。Note 6：市面上TMB底物最低和最高有10倍的显色差异，建议选择市面上最强的TMB显色底物。需要提前确认检测仪器的信号线性范围，比如一般的酶标仪吸光度值的信号线性范围在0-3，吸光度值在3-4之间为非线性的，信号值超过3时，信号和亲和力的相关性变差。Note 7：显色时间可适当的延长，一般来说在30分中内显色的信号值和显色的时间成线性。Note 8：条件的选择最终是通过阳性噬菌体的信号值决定的，阳性噬菌体的亲和力大小是一个非常重要的选择参数。如阳性噬菌体的亲和力为1nM时，筛选的目的是得到高亲和力的抗体，可以选择阳性噬菌体的信号在OD值为0.5时的条件作为最终的筛选条件，这样很多OD值很小的低亲和力的抗体均被过滤掉；筛选的目的是尽可能得到多的亲和力抗体，可以选择阳性噬菌体的信号在OD值为2-3时的条件作为最终的筛选条件，低亲和力的抗体在OD值上也不会太小，可以得到体现。不论如何抗原的浓度大小决定了选择性，选择较小的抗原浓度进行反应是信号和亲和力大小匹配的关键和趋势性选择，信号大小的调节可以通过酶联抗体浓度，高显色能力的显色液和显色时间进行调节。如果在一块板的检测中未知样品的信号值大小呈合理的分布是ELISA条件较好的表现。Part 4 - 总结 - ELISA用于杂交瘤和噬菌体展示筛选是ELISA用于亲和力测定方法的一种变种，想要得到好的信号和亲和力大小的相关性，低抗原浓度条件下进行方法学开发是必须的。低抗原浓度条件下会有低的信号值，通过增加酶联抗体浓度，选择高显色能力的显色液和延长显色时间，增加ELISA灵敏程度是ELISA优化的技术方向。由于检测样品的多样性和复杂性，高灵敏的ELISA检测体系必然会导致背景信号的增加，无法得到很好的信噪比，疏水性的酶标板条，尽可能低的样品的稀释倍数是解决这个问题的关键。一个稳健的能用于杂交瘤和噬菌体展示筛选方法是ELISA各种耗材，试剂和实验条件的完美组合，需要对试剂耗材的多种可能进行探索，也是平台经验的系统汇总，以下是用于筛选方法的优化方向的汇总。 以上，就是小奥带给大家的第四篇ELISA方法学开发的干货内容！我们下期再见哦！