【分享】欧盟兽药检测方法（之四）

8 样品和取样程序
注意：留意6.3.1节和国际标准化组织文件78/2-1982（E）以及由文件2052/Ⅵ/84-EN的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 样品的性质；即必须符合导则64/433/EEC中定义的内容，以能够进行肉样中残留物的测定。如没有符合要求的样品可用动物体液或粪便做测定用的样品。
8.2 样品量；样品量要大到足以完成方法以及重复测定的要求。本方法测定β-激动素作一次测定时所要求的样品量为1mL的血浆或0.2g的组织。
8.3 样品采集和包装的方法，必须使实验室易于鉴别和使用。
8.4 样品的包装、贮存和运输的方法，必须保证样品的完整性，不能影响测试的结果。
做克喘素分析的样品，必须在低于-18℃的温度下贮存和送输。

9 测定步骤
9.1 提取步骤
9.1.1 血浆
9.1.1.1 血浆样品按照9.2节中描述的那样参和均匀后，与12mL pH=12的缓冲溶液（6.2.1）混合好，装入20mL的带有螺帽的试管中。
9.1.1.2 加入6mL乙酸乙酯，在一台往复式振荡器上振荡10分钟。
9.1.1.3 以1600g的离心力离心5分钟。
9.1.1.4 将有机相转移至根含有1mL 0.2mol/L硫酸的带有螺帽的10mL的试管中。
9.1.1.5 混合物在一台往复式振荡器上振荡10分钟，以1600g的离心力离心5分钟。
9.1.1.6 有机相在真空下蒸发到只剩下水相，然后加入4mL乙酸乙酯和正己烷的混合有机溶剂（2：1，v/v）。
9.1.1.7 混合液做短时间的振荡后，进行低速离心，废弃上层有机相。
9.1.1.8 残留的硫酸相用1mL 2mol/L的氢氧化钠中和后，再用5mL的乙酸乙酯提取。
9.1.1.9 有机相倾入一根10mL的玻璃试管中（7.10），通氮气在40℃水浴上蒸发至干。

9.1.2 组织样品
9.1.2.1 准确称量组织样品后，装进一根含有3mL pH=7的Sorensen缓冲溶液（6.3.2）的20mL玻璃试管中，加入500pg同位素[2H9]示踪原子标记的克喘素后，用Polytron均质器（7.2）均质混合1分钟。
9.1.2.2 以1800g离心力离心样品15分钟，上层悬浮液倾入一根带螺帽的20mL的试管中。用1mL 2mol/L的氢氧化钠使水相碱化后，加入6mL乙酸乙酯，放在一台往复式振荡器上振荡10分钟。
9.1.2.3 接下去样品按照血浆的提取操作步骤进行提取（9.1.1.3到9.1.1.9）。
9.2 为质量控制进行的添加
9.2.1 血浆样品； 1mL不含克喘素的人体血浆若干份，各添加50 L浓度为10ng/mL，含有[2H9]示踪原子标记的克喘素（作内标用）的水溶液（6.2.5）。每份还要添加不同量的不含示踪原子标记的克喘素，使该血浆样品系列中，克喘素的浓度范围为5 250pg/mL。1mL空白样品中，只添加作内标用的有[2H9]示踪原子标记的克喘素。
9.2.2 组织样品；0.2g不含克喘素的组织样品若干份，各添加50 L浓度为10ng/mL，含有[2H9]示踪原子标记的克喘素（作内标用）的水溶液（6.2.5）。每份还要添加不同量的不含示踪原子标记的克喘素，使该组织样品系列中，克喘素的含量范围为10 500pg/g。0.2g空白样品中，只添加作内标用的有[2H9]示踪原子标记的克喘素。
9.3 进行衍生反应。
值得注意的是，为了除去衍生反应试管中的水，试管（7.10）事先用丙酮洗涤，然后放在无水硫酸钠上干燥，丙酮挥发干净后，加入40 L的PFPA，盖紧试管盖，在室温下放置，直到分析时使用。
9.4 GC-MS分析
9.4.1 GC实验条件
9.4.1.1 进样体积 1 L衍生反应后的样 品（9.2）
进样温度 290℃
进样方式 移动落针式进样
起始温度 180℃
升温梯度 8℃/min
第一终止温度 230℃
升温梯度 20℃/min
第二终止温度 290℃
9.4.1.2 有[2H9]示踪原子标记的克喘素的保留时间是5.22min，无示踪原子标记的克喘素的保留时间是5.16min（数据来自Girault和Fourtillan，1990）。
9.4.2 质谱实验条件设置

离子化模式 负离子化学电离
离子化温度 180℃
发射电流 300 A
电子能量 100eV
被监测离子 m/z=368（克喘素）
m/z=377（内标）
反应气体 甲烷，在离子源的压力约0.8T0rr
9.4.3 克喘素含量的测定
克喘素和[2H9]克喘素的负离子化学离解的质谱，通过扫描四极杆质量过滤器而被记录下来，每1.1秒扫描一次，扫描质量从250到450。将仪器聚焦在单一离子模式时，可测量m/z368（克喘素的）和m/z377（[2H9] 克喘素的）两种离子碎片，从而实现对克喘素含量的测定。每次对质量范围扫描的驻留时间是100毫秒。
9.4.4 克喘素的确证（参看10.1）

10 结果的计算
10.1 校正曲线
用一条线性校正曲线来进行结果的定量计算，该线性曲线是用[2H9]克喘素（内标）与标准克喘素的离子强度比，对标准的浓度（例如：pg/进样小瓶）进行最小二乘法而拟合得出的。当然浓度在拟合计算中是一个输入变量。
该线性校正曲线是用7个数据点作出来的（线性相关系数r=0.9998），它离原点的截距几乎是零。血浆的校正曲线每天都能重复，相对标准偏差仅为4 （数据来自Girault和Fourtillan的报告，1990）。
10.2 回收率
提取回收率约为80 ，但通过使用[2H9]克喘素作内标，，可以使所有的变动性大为降低。
10.3 准确度与精密度
方法的精密度是由Girault和Fourtillan进行测量的（1990），组织和血浆样品的精密度实验结果列出在表1中。
表1
样品 理论浓度 n 观察浓度 SD CV 误差
名称 （pg/mL 的平均值 （ ） （ ）
或g） （pg/mL
或g）
血浆 200 10 196.3 5.89 3.0 -1.9
100 5 99.3 3.41 3.4 -0.7
20 5 20.0 0.74 3.7 +0.2
5 10 4.8 0.61 12.8 -4.3
组织(肾) 200 10 212.7 15.6 7.3 +6.4
20 10 18.9 1.7 9.0 -5,5

10.4 确证
为了证实至少可以同时测定出4种离子的响应比，必须要对标准物和未知样品的实验数据都进行计算才行。
一衍生化离子的质量表示如下：
M.W M.WD. -----------离子----------
克喘素 276 404 368 297 312 350 404
-FPA
[2H9]克 285 413 377 297 313 359 413
喘素-FPA
M.W = 纯化合物的分子量。
M.WD = 衍生化反应后的分子量。
根据欧共体标准（EC-criteria）的要求， 至少有4 种离子要进行监控。每一种离子的响应值，其最大值应该达到至少超过平均噪音的 3倍标准偏差（ 3D）的要求。如果达到了这一标准，全部被监控的离子就可以按照3种不同的比率来进行计算。对标准分析物来说，在相应的浓度范围内，更适合以相同的比率来进行计算。对鉴定为阳性反应的未知样品，应该要求它们的响应值，全部落在标准物响应平均值的 10 的范围内。
注意：由于MS-设备经常发生波动，因此无法保证严格执行此标准。鉴于此，可以用一种考虑了实验波动性的标准来替代此标准。替代标准中未知样品的响应值比率，应该是相应标准物响应值比率 3倍标准偏差范围内。
11 特殊情况
12 关于实验操作的注意事项
13 质量控制，标准物质，参考物质和抗体
14 实验报告
15 缩略语表
一份重要的缩略语表给出在第12节附件I。
16实验操作流程图

组织 加缓冲溶和 均质
回收标准物
血浆



加缓冲液和 溶剂
回收标准物 提取



计算 GC/MS 衍生
结果 反应