一道黑
第1楼2008/12/01
9 步骤
9.1水解
置5mL胆汁、15 mL pH7磷酸盐缓冲液和50μl葡萄糖苷酸酶于20mL万用瓶中，并在37℃下保温过夜。
9.2 Extrelut柱净化
按生产商说明制备Extrelut柱，在50mL(MF-24)Quik-fit管上连接34/35－24/29 Quik-fit Expansion接头，将柱接在接头上。
加入胆汁／缓冲液混合液，放置30分钟，用两份35mL乙醚洗脱柱。
在氮气流下将乙醚浓缩至约5mL，然后洗入一10mL锥形离心管，然后用氮气吹干。通常吹干后留有少量残留物。将提取物再溶于2mL40%(V／V)二氯甲烷／己烷。
9.3氰基Bond－Elut柱进一步净化
用2份2mL甲醇洗两次和2份2mL石油醚淋洗以制备氰基Bond－Elut柱。在柱干之前加入提取液并用2mL二氯甲烷／已烷(70∶30V／V)淋洗。
用两份甲醇和两份2mL石油醚淋洗以制备氨基柱，将氨基柱注满乙醚，然后将氰基柱接在上面。用3mL乙醚从氰基柱洗脱至氨基柱。弃去氰基柱，用2mL含2%(V／V)甲醇的二氯甲烷淋洗氨基柱。
用3mL含33%(V／V)甲醇的二氯甲烷洗脱氨基柱，收集洗脱液于螺旋盖离心管中。
9.4 衍生化
将甲醇／二氯甲烷提取物吹干，然后溶于1mL庚烷及100mL HFBA(取自一新安瓿瓶)。盖上试管然后在Techni Dri加热块上将提取物保持在80℃下20分钟，加热3分钟后振荡以保证两层的充分混合，20分钟后取下试管让其冷却。
同时将1.2-二苯乙烯类药物标准进行衍生化。标准浓度=1ng、10ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg／mL。
9.5 衍生化后柱净化
为改善色谱分离，加5mL PH6的磷酸盐缓冲液用来净化衍生化的提取物。剧烈振荡30sec整，然后静置分层(如有必要，在2000rpm下离心5分钟)。用定于0.7mL的吸液器小心地吸出上层的庚烷于GC－MS用小瓶。立即盖上小瓶。用于气相色谱－质谱分析。
9.6气相色谱－质谱分析
9.6.1气相色谱参数设置如下：
柱：J&W弹性毛细管柱，SE-54，15m×0.25mm
进样：0.5 L手动进样
温度：接口：230°C
进样口：220°C
柱箱温度：
从温度 至温度 速率 时间 总时间
(℃) (℃) (℃／min) (min) (min)
55 55 — 1.0 1.0
55 240 20 9.2 10.2
240 240 — 10.0 20.2
毛细管 关=0.00 开=0.7
分流 关=0.00 开=20.7
载气：氦
流速=1cm3／min 进样口压力=10psi
9.6.2质谱参数：
离子化器：
方式：化学电离(CI)
温度：130℃
压力：50乇(Torr)
歧管温度：90(±5)℃
电子倍增器：1.2KV
电子能量：70eV
反应气：己烯雌酚(DES)用甲烷，双烯雌酚(DE)和已烷雌酚(HEX)用氨。
用一适宜的校准化合物，通过调节仪器控制以得到最佳峰高及峰型来设定其它质谱参数。CVL用全氟三丁胺(PFTBA)。
9.6.3在CI方式，用氨作反应气，在m／z=50和700间扫描，运行(a)为已烷空白(b)为10μg／100μL1,2-二苯乙烯类药物标准。收集1000扫描。
9.6.4对准1.2-二苯乙烯类药物标准的色谱峰。在谱图上寻找三个选定离子的精确质量。
己烯雌酚(DES) 464，465，661(CI用CH4)
双烯雌酚(Dienvestrol) 462，480，676(CI用CH4)
已烷雌酚(Hexoestrol) 466，484，680(CI用CH4)
9.6.5用这些质量设置或修改多离子检测(MID)扫描表，建立扫描表。
9.6.6重复实验运行已烷以保证未带出1.2-二苯乙烯类药物。
9.6.7应用刚建立的扫描表，在GCMS上分析样品和标准。建议如下：
(a)先分析100μg标准，以确保MID设定正确，然后分析已烷。
(b)按浓度增加的顺序分析标准。
(c)在峰从柱流出进入离子源前将灯丝打开至100扫描，该峰扫描后关闭灯丝。再按此方式扫描后面的峰。
(d)每次进样间实验运行已烷。
10结果
如果GC－MS数据符合下列限定，则需确证样品中怀疑存在1.2-二苯乙烯类药物：
1.GC峰与标准有相同的保留时间。
2.扣除本底后该峰的质谱图存在所有选定的离子。
3.所存在的选定离子间比例与标准相同。
如样品中存在1.2-二苯乙烯类药物，并满足上述限定，则可用两种方法之一计算存在的估计量：
1.用数据系统计算峰面积并建立定量表。用一相应的标准或一系列标准建立一个定量库。将样品与此对照得到定量报告。这是推荐方法。
2.测量样品和相应标准的峰面积。所提供样品中总1.2-二苯乙烯类药物的浓度可用下式求得：
样品峰高
标准峰高×标准浓度
检测限：已烯雌酚(DES)5μg／L胆汁
已烷雌酚(Hexoestrol)1μg／L胆汁
11 －12 略
13 质量控制 标准和基准物质
14 实验报告
给出用来鉴定样品的说明；注明使用的方法；结果及其表述的形式；实验过程中观察到的特殊现象；以及有可能影响结果，而方法中没有规定或认为是随意任选的任何操作。
15 缩写表
最重要的缩写列表于12节的附录Ⅰ中。
16检验流程图
胆汁 酶水解 EXTRELUT柱 乙醚洗脱 干燥 二氯甲烷／甲醇 氰基BOND-ELUT柱 洗脱 氨基BOND-ELUT柱 洗脱 二氯甲烷／甲醇 用HFBA衍生化 用磷酸盐缓冲液净化 HFB衍生物GC-MS分析 计算结果
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