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【求助】样品检测相关问题?

化学药检测

  • 近做一个分子量在70KD左右的糖蛋白,
    用色谱柱的型号是TSK G2000 SWXL,7.8*300mm)
    流动相: 40mmol/L磷酸盐缓冲液,300mmol/LnaCl PH:6.8用0.22um过滤膜过滤
    色谱条件: 流速0.5ml/min,上样量20微升
    柱温: 20-25度
    紫外检测波长: 280nm
    系统压力: 29~31bar
    步骤是:
    1.分别用甲醇、超纯水冲洗系统至基线平衡,(柱子用甲醇保存)
    2.换配置好的流动相以0.5ml/min平衡色谱柱到基线平衡。
    3.取样品20微升上样品,(经过0.22um滤膜过滤,)记录时间40min,
    4.这个柱子用了一年多,一直没有用预柱。

    结果色谱峰拖尾严重,一直都是这样,对称因子达不到药典的要求,塔板数也不够。
    这个柱子用甲醇保存过,也用叠氮钠保存过,现在怀疑是不是柱子塌陷?
    我们用另外一个样品(人血白蛋白)做对照时就不存在拖尾现象,但是测试这个样品就拖尾严重,请高手指点,
    或者有哪位战友也用过这个柱子的传授一下是怎么保养柱子的,实验方法怎样?另外这个柱子能否反冲?
    这是所测样品的色谱图(拖尾严重);



    另外一个是采用同样方法测得人血白蛋白样品,基本无拖尾。

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  • lwjxzj

    第1楼2010/06/19

    样品和对照品的溶剂都一样的,和流动相成分一样,

    是不是样品溶液对PH的影响不大,样品等电点在4.5-5.5左右,

    样品中存在与主成分保留时间相似的物质,这个有可能,我的样品是有两个亚基经二硫键连接而成的,可能存在比我样品分子量稍高的二聚体,但是二聚体出峰时间应该在前面的,不应该拖尾啊?

    请假用过这种柱子的朋友,是怎样冲洗和保存再生的?用的什么试验方法?

    我想请教,根据这个实验结果,能看出我的柱子是不是存在问题呢?需要对柱子反冲处理一下吗?

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  • 小卢

    第2楼2010/06/19

    第一个图形的样子,我怀疑是ph值或盐浓度的问题,建议从新配一下流动相试下,再就是是不是进多针后也是这种情况呢?还要考虑一下你的柱子是否开始没有平衡!

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  • 小卢

    第3楼2010/06/19

    不同的填料,有不同的出来方式,有时候还要看平时流动相的比例!

    lwjxzj(lwjxzj) 发表:样品和对照品的溶剂都一样的,和流动相成分一样,

    是不是样品溶液对PH的影响不大,样品等电点在4.5-5.5左右,

    样品中存在与主成分保留时间相似的物质,这个有可能,我的样品是有两个亚基经二硫键连接而成的,可能存在比我样品分子量稍高的二聚体,但是二聚体出峰时间应该在前面的,不应该拖尾啊?

    请假用过这种柱子的朋友,是怎样冲洗和保存再生的?用的什么试验方法?

    我想请教,根据这个实验结果,能看出我的柱子是不是存在问题呢?需要对柱子反冲处理一下吗?

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  • shendanyu

    第4楼2010/06/21

    调节一下流动相的pH

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  • 小卢

    第5楼2010/06/24

    楼主有没试下,能解决吗?

    shendanyu(shendanyu) 发表:调节一下流动相的pH

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  • wywywywywywy

    第6楼2010/06/25

    可以试着调节一下流动相的pH呀。

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