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摘要：智舌是以电化学传感器为基础的，组合脉冲弛豫谱为信号激发响应模式，检测和评价溶液整体品质特征的现代化新型分析检测仪器。本文利用智舌样品检测无需前处理，检测评价溶液整体品质特征的特点，以酵母菌为例，通过评价酵母生长过程中培养基组分的变化状况，探索智舌在微生物快速检测中的应用。试验结果显示，通过计算智舌特征值的总功率，利用S曲线模型中的Logistic模型的拟合总功率与时间变化曲线，能够得到与OD值曲线基本一致的酵母生长曲线。并且，通过对拟合曲线阈值的确定，建立了响应时间与原始酵母接种量之间的线性模型。智舌有望成为微生物快速检测或微生物生长状况监测评价的现代化新型技术。
关键词：智舌；总功率；酵母模型
智舌是一种以具有低选择性、非特异性和交互敏感性的化学传感器阵列，结合合适的模式识别方式或多元统计方法构成的，检测溶液整体质量品质特征的现代化分析检测仪器[1]。智舌能够很好的显示液态样品的综合信息而成为液体食品诸如酒类、饮料等的品种区别、真假鉴别和示踪货架期品质变化的一种新型检测技术，因其具有无损样品、息量丰富、易智能化、使用寿命长、成本低廉、快速简便等优点而成为当前国内外有关领域关注的焦点和研究的热点，已经在液体食品的品质检测中有较多的研究和应用[2,3]。
微生物快速检测分析一直是食品工业以及食品安全控制的研究热点。快速、简便、经济、可靠的微生物的检测技术，是监测、监管、预防、质控和及时诊断等多方面有效实施的保障，是多级检验检疫部门的迫切需求[4,5,6,7]。传统的微生物检测方法，一般首先通过培养基对微生物数量进行扩增，然后通过镜检或是特异性显色反应的方法进行判断，但是消耗的时间长，效率低。而微生物在培养基的生长过程中，会经历延滞期、指数期、稳定期、衰亡期的四个变化过程。微生物在四个变化过程中，不但其数量存在明显的变化规律，同时，其赖以生存的培养基组分也存在显著的变化过程。特别是在延滞期进入指数期的阶段，细胞进入以几何级数增长的时期，培养基的变化非常显著。而延滞期的长度又和菌种的接种量有关。
本研究利用智舌[8]样品无需前处理、检测速度快、评价溶液整体变化特征的特点[9,10,11,12,13]，主要针对培养基中的还原、氧化活性物质进行响应，通过它得到关于微生物在一定的液体培养基中和确定的培养时间后的综合信息。通过微生物经历延滞期的时长来确定其原始的接种量。本文以酵母菌为例，探索电子舌在微生物快速检测中的应用方法。研究结果显示，智舌能够作为一种新型的快速技术应用于微生物快速检测当中。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种：本研究用的酵母菌是由安琪酵母股份有限公司提供的高活性干酵母。
由于安琪酵母的高活性，本研究没经过前增菌和培养的过程，直接选取活性干酵母不做任何前处理作为检测样本，无菌操作称取不同质量的干酵母接入灭菌的培养基进行培养，每隔2小时取样检测，一个样品检测6次。实验做3个平行。
同一样品，用浊度法测其生长曲线，用721型分光光度计，波长560 nm测其OD值。以OD/560为纵坐标，时间为横坐标作曲线[14]。以此国标方法的测定结果作为本研究的对照。
1.1.2 培养基：40g葡萄糖、4g硫酸铵、4g硫酸镁、2g磷酸二氢钾、4g氯化钠配制成2000ml液体培养基。该培养基置于115℃高压15min灭菌。
1.1.3 主要仪器：
检测仪器为智舌系统（由本课题组独立研制开发提供）。智舌具有样品无需前处理，检测速度快，评价溶液整体品质特征的特点 [1]。721型分光光度计（上海光谱仪器有限公司制造）。
1.2检测方法
智舌以组合脉冲弛豫谱为信号激发响应模式，利用铂、金、钯等非特异性惰性金属电极将检测溶液的物理化学属性转变成为电流信号，结合特定的数学方法评价溶液整体品质特征的变化状况。图1为智舌激发响应信号，表1为参数设置列表。
图 1 智舌电势激发和电流响应信号
Fig. 1 The applied potential and response current of pulse voltammetry
表1 智舌参数
变化幅度
|
变化范围
|
不同频率间隔时间
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|
|
|
0.2V
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1.0V 一 -1.0V
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5S
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用智舌检测过程中，每个原始接种浓度分别做3个平行样，智舌传感系统通过传感器阵列对培养基连续测试6次。电极阵列有6 种不同的电极，每种电极又有3个频率段，1个电极的1个频率段的1 次检测就有41个有用的数据。每次检测前先检测10次0.01mol/L的NaCl使电极趋于稳定，每检测完一个被测液体后，对电极阵列打磨，蒸馏水冲洗；参比电极用蒸馏水清洗，然后用滤纸吸干。
1.3 数据处理
1.3.1 各时间段的总功率计算
由智舌软件所提取的智舌检测中所得到的特征值41个，41个特征值是把图1中的响应信号图上的所有顶点和拐点取值所得到的，将样品一个时间段的一次检测的41个数据相加得到总功率WT，再把该时刻对空白培养基检测得到的41个数据相加得到W0，该时段的总功率值
W=WT - W0 ,
以总功率为纵坐标，时间为横坐标做酵母的总功率生长曲线。
数据处理软件：origin7.5。
2．结果与讨论
2.1浊度法测定不同浓度酵母菌的生长曲线
图2是用浊度法测定的原始接种量分别为0.001g、0.005g、0.007g、0.01g、0.05g的酵母培养基中的生长曲线。由图中5条曲线分别用不同的形状来表示不同原始接种量的生长曲线
图2 吸光度检测的不同原始接种浓度的酵母生长曲线
Fi.2 The growth curves of yeast detected by turbidimetry
由图2中可知，由于酵母菌原始接种量不同，其接种的酵母进入生长指数期的时间也不一样。浓度最低的0.001g接种量在16时进入指数生长期，0.005g、0.007g、0.01g接种浓度分别在12时，8时和6时进入指数期的生长，而浓度最高的0.05g接种浓度则没有出现明显的延滞期。
2.2智舌传感系统监测不同菌种浓度的培养基总功率的生长趋势
根据智舌每个电极每次采集41组数据，并以这41组数据计算得到总功率W，以总功率W为纵坐标，以时间为横坐标做酵母的生长曲线图。如图3
图3 是用钯电极的1Hz 频率段对5个不同接种浓度的总功率关于时间的生长曲线图；
Fig 3
由图中不同原始接种浓度的培养基的生长曲线，我们可以得出智舌的总功率模型对酵母生长的延滞期，指数生长期和平稳期都有很好的区分。
从图3，可以看出钯电极在1Hz频率段总功率生长曲线图虽然在曲线的圆滑性上有所缺陷有个别点出现少许的偏差，但还是可以清楚的看出菌种进入指数生长期的时间并和吸光度的检测结果基本一致。接种浓度最低的0.001g在生长到16个小时的时候进入指数生长期，而浓度稍微高一点的0.005g在12时进入指数期的生长，而后面的0.007g、0.01g、分别在8时和6时进入指数期。而浓度最高的0.05g原始接种量没有出现明显的延滞期 ，而是直接进入了生长的指数期。
图4 曲线经过Logistic模型拟合之后的生长曲线图；
Fig 4
选用S型曲线模型Logistic模型对总功率曲线进行拟合，得到模型的拟合图4 。Logistic模型：
Logistic方程能有效描述微生物生长，很好的区分开微生物生长的延滞期、指数期和平稳期，且使用方便，在细菌生长动力学研究的文献中被广泛使用[15,16,17]。在图4中曲线通过Logistic模型拟合的数据。数据在经过模型的拟合之后，虽然有个别点出现偏离，但是总体可以体现出微生物生长的特征。
表2 不同浓度模型的拟合系数
Table 2
原始接种浓度
|
相关系数r
|
标准差s
|
0.001g
|
0.9595 8481
|
0.3086 0122
|
0.005g
|
0.9745 2991
|
0.4369 8749
|
0.007g
|
0.9499 2665
|
0.5883 8879
|
0.01g
|
0.9648 5848
|
0.4807 9965
|
0.05g
|
0.9762 6220
|
0.3547 0057
|
表2为5个不同原始接种浓度的模型拟合相关系数，由表2所得的相关系数r和标准差s都基本符合模型要求。从图4我们可以看出经过拟合以后的曲线基本和吸光度测得的曲线一致。
2.2模型拟合曲线阈值的确定
得到拟合曲线之后，我们可以设定一个阈值M，做出模型到达阈值的时间关于模型的原始接种量之间的关系，在图4阈值在0.01g模型的最低点0.8到0.001g模型的最高的3.0之间取值。把值0.8——3.0之间分别取值1.5、2.0、2.5、3.0 四个值进行比较。
图5 四个阈值分别和各个模型的交点
Fig 5
图5中的4条直线分别代表了4个阈值，每个阈值都和5个不同接种浓度的模型有一个交点，而这个交点所对应的时间即为该模型达到阈值所需要的时间（IDT），通过该时间与原始接种量（U）之间的关系来选取合适的阈值。在一定范围内，原始接种量的对数Log（U）与IDT呈直线关系[18]。
表2 Log（U）与IDT的直线拟合系数
Table 2
阈值 | 相关系数r | 标准差s |
1.5 | 0.9629 5997 | 1.8610 8913 |
2.0 | 0.9788 3833 | 1.3858 1584 |
2.5 | 0.9740 2893 | 1.5122 2077 |
3.0 | 0.9609 3948 | 1.8046 0653 |
根据表2中的数据比较得出，阈值M=2.0时IDT与Log（U）之间的相关系数最大，所以我们选取2.0做为检测的阈值。
图6 M=2.0时的Log（U）与IDT的标准曲线
Fig 6
图6为各个不同浓度的模型到达阈值2.0的时间（IDT）和原始接种量的对数Log（U）之间用直线回归的方法建立标准曲线。我们可以通过这个标准曲线对未知的样品进行检测。
2.3模型对已知样品的预测
利用建立的模型对已知接种浓度的样品进行预测比较，已知样品的原始接种量为0.02g由以上方法智舌检测建立模型如图7。
图7 样品拟合生长曲线
Fig 7
根据图7拟合的曲线，取阈值在2.0时的IDT值，IDT=7.69897。根据图6的直线回归标准曲线，得到Log（U）= -1.7334 , 最后得到预测的原始接种量U=0.01848g 。 与样品真实的接种量U′=0.02g进行比较得到预测值的相对误差为7.6%。
3. 结论
本研究以酵母菌为研究对象，利用智舌样品检测无需前处理，检测速度快，评价溶液整体品质特征变化状况的特点，通过将酵母菌生长过程中培养基组分的变化状况转变为电化学信息，利用特征值总功率和Logistic模型拟合的方法，在确定的阈值M=2.0下，建立了模型达到阈值所需要的时间（IDT）与原始接种量的对数Log(U)之间的线性模型。研究结果显示，智舌有望成为微生物快速检测一种新型技术。
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