zhaohua8011
第5楼2011/08/03
这是论坛上的一个帖子:在一个资料上看到了新柱老化平衡的相关操作,请教一下各位具体操作需要这么麻烦么?
你学习一下:
普通C8及C18反相色谱柱(C8&C18 Reversed-phase chromatography column)
(1)准备新鲜超纯水及色谱级乙腈或甲醇,冲洗色谱仪器系统,保证仪器系统管路干净。(新柱老化前,此步决不可忽略)
(2)将色谱柱反向连接,不接检测器。用水-有机相(90:10~95:5),以0.3~0.6ml/min流速冲洗20~30min。(目的是冲洗出柱入口端无机杂物与筛板孔杂物,使筛板正常)
(3)再将色谱柱正向连接,不接检测器。用水-有机相(90:10~95:5),以0.3~0.6ml/min流速冲洗20~30min。(目的是冲洗出柱出口端无机杂物与筛板孔杂物,使筛板正常)
(4)连接检测器,开启柱温达30℃~40℃,用水-有机相(90:10~95:5),以0.3~0.6ml/min流速冲洗4h以上。(目的是充饱和色谱柱,去除柱内空气)
(5)用水-有机相(10:90~5:95),以0.3~0.6ml/min流速冲洗2h以上[或在120min内以水-有机相(95:5→0:100)梯度变化,以0.3~0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂,以0.3~0.6ml/min流速冲洗1h以上→最后用100%有机溶剂,以1ml/min流速冲洗1h以上。(目的是老化色谱柱)
(6)在平衡前根据水相-有机相的比例,首先调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例,以1ml/min流速冲洗30左右(目的是相平衡过渡)。如果流动相中含有缓冲盐,决不可在柱老化后立即用流动相平衡,必需先用90%以上水进行预平衡30min以上,否则,会导致缓冲盐在柱内析出结晶,严重时会将新柱永久不可逆地损坏。
(7)然后更换成新制并经0.45um滤膜过滤,超声脱气后的流动 相,按检测方法平衡至少1h,待基线稳定后,开始进样检测。
(8)由于是新柱首次使用,在进样完成后需立即对色谱柱进行净化和有机溶剂饱和。方法是:用水-有机相(90:10~95:5),以0.6ml/min流速冲洗1h以上→再用水-有机相(90:10~95:5),以1ml/min流速冲洗30min以上(或者采用溶剂梯度变化至100%有机相冲洗120min以上)→最后用100%有机溶剂,以1ml/min流速冲洗1h以上。若流动相中有缓冲盐,建议用100%水冲洗1h以上后,再重复上述净化程序(但个别品牌C8或C18色谱柱不耐受纯水冲洗者例外)。 在新色谱柱使用几次,均正常后,运行完毕净化处理程序可简化为:用水-有机相(90:10~95:5),以1ml/min流速冲洗1h以上→再用100%有机溶剂,以1ml/min流速冲洗30min以上→选择柱说明书中保存条件(Storage Conditions)规定的保存溶剂(Storage Solvent)冲洗10倍柱体积以上→封口,保存。
(9)净化完毕,若次日不再使用,可取下色谱柱,用封头螺丝密封,交色谱柱管理人员入库保存于防尘环境下,备案。
(10)备注:老化用有机溶剂推荐使用色谱级甲醇,不同品牌色谱柱需区别对待;水需用去离子的超纯水。若色谱柱使用后入库保存,长时间未使用,重新使用时仍需重新饱和。方法是:用水-有机相(90:10~95:5),以0.6ml/min流速冲洗1h以上→再用100%有机溶剂,以1ml/min流速冲洗30min以上→然后调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例,以1ml/min流速冲洗30左右→最后用流动相平衡1h以上,进样检测。必需注意流动相pH值不能超过色谱柱pH耐受范围,过酸容易使键合相变态,过碱则易导致硅胶溶解柱床塌陷。
(11)特别提示:当供试品溶液中含有一定量表面活性剂,多次进样后,由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜,导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时,处理方法如下:将色谱柱反向连接接,不接检测器,用水-乙腈(90:10~95:5),以0.6ml/min流速冲洗2h以上→再用100%乙腈,以0.6ml/min流速冲洗1h以上→然后正向连接好色谱柱,用水-乙腈(90:10~95:5),以1ml/min流速冲洗1h以上→再用100%乙腈,以1ml/min流速冲洗1h以上,即可恢复。