省部重点实验室
第1楼2012/04/29
生物质谱
对于双向电泳中感兴趣的蛋白质点,可以从聚丙烯酰胺凝胶中切下,经过酶解后采用生物质谱进行分析鉴定。生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术,其基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子之间的荷质比(M/E)的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解(水解Lys或Arg的-C端形成的肽键)成肽段,对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种:基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和离子阱质谱(ESI-MS)。
基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)
MALDI的电离方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物)中并形成晶体,当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时,基质分子吸收激光能量,样品解吸附,基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测定其分子量,MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱,非常快速(每次分析只需3~5min),灵敏(达到fmol水平),可以精确测量肽段质量,但是如果在分析前不修饰肽段,MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列(钱小红等,2003)。
离子阱质谱(ESI-MS)
ESI-MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电,在N2气流的作用下,液滴溶剂蒸发,表面积缩小,表面电荷密度不断增加,直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限,液滴爆裂为带电的子液滴,这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状,这时液滴表面的电场非常强大,使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器(Whitehouse et al., 1985;Fenn et al. 1989)。ESI-MS从液相中产生离子,一般说来,肽段的混合物经过液相色谱分离后,经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析,给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是分析时间一般较长。
目前,许多实验室两种质谱方法连用,获得有意义的蛋白质的肽段序列,设计探针或引物来获得有意义的基因。随着蛋白质组研究的深入,又有多种新型质谱仪出现,主要是在上述质谱仪的基础上进行改进与重新组合。
不足与展望
由于蛋白质组是一个动态、变化的整体,生物体内的蛋白质不能像核酸一样通过PCR扩增来增加样品量,因此其复杂性远远大于基因组。
双向电泳的通量、灵敏度和规模化均有待于进一步加强。二维凝胶电泳有分离容量的先天限制,染色转移等环节操作困难费时,低丰度蛋白难以辨别,和质谱技术的连用已经成为瓶颈。因此,国际上开始重视研究以色谱/电泳-质谱为主的技术平台。另一方面,酵母双杂交技术虽已经被用于研究蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统,但仍缺乏快速、高效的手段获取复杂蛋白质相互作用的多维信息。蛋白质的生物信息学研究,虽然已有应用,但仍困难重重。
虽然蛋白质组学的研究有它的局限性,但是技术改进并未停止。新技术的补充和双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。例如,在样品分离过程中对样品预分离以减少样本的复杂性,采用激光捕获显微切割技术以更为精确的分离需要的组织和细胞,固相化pH胶条和窄范围的pH胶条的使用可以分离到更多的蛋白质点,荧光染料的使用使得蛋白质的分离更加准确可靠,切胶和酶解的自动化减少了样品操作过程中角蛋白的污染。技术方面,二维色谱(2D-LC),二维毛细管电泳(2D-CE),液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术都是目前发展的主要方向。另一种策略是以质谱技术为核心,直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质组相互作用研究的重视,发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也受到科学家的关注。此外,蛋白质芯片的发展也十分迅速,并已经在临床诊断中得到应用(钱小红,2003;Aebersold et al., 2002