GST-pulldown操作流程

省部重点实验室

2012/06/15

私聊

生命科学仪器综合讨论

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160）

实验操作程序：

材料及试剂

探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物

细胞蛋白裂解液，洗脱液：

PBS及PBS+1%Triton-100

PBS (1L)

NaCl： 8g

KCl： 0.2g

Na2HPO4： 1.44g

KH2PO4： 0.24g

加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！

PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃

（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）

1：原核融合蛋白A的获得

1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株

1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜

1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N

1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀

1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉

1.6：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用

2：真核融合蛋白B的获得

2.1：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染

3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融

4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。

5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。

6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。

7：吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。

8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。