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检测外源蛋白质在大肠杆菌中的表达
省部重点实验室
2012/10/02
私聊
生命科学仪器综合讨论
如果靶基因亚克隆在含有
T7
启动子的表达载体(如质粒载体
pET-22b
和
pET-15b
等)上,那么重组质粒应转化入
λ
DE3
溶源菌菌株
[
如
BL21(DE3)
、
JM109(DE3)
及
Qrigami B(DE3)
等
]
中,以进行靶基因的表达。
(一)
溶菌酶
-DNase I-
反复冻融裂解菌体法
1.
单菌落接入
4ml LB
培养液中,过夜培养。再以
1:20
转接至
2
管
4 ml LB
培养液中,当
OD
600
为
0.6-0.8
时,一管加
IPTG
诱导,另一管不加
IPTG
作对照。
2.
离心收集菌体,每管加
Binding buffer 100
μ
l
,
DNase I (2,000 u/ml) 10
μ
l
,溶菌酶
(2 mg/ml) 5
μ
l
。菌体充分悬浮后,在
-20
℃
放置
20
分钟,室温融化,如此反复冻融
8-10
次。
3.
吸取
20
μ
l
加入一洁净的
EP
管中,
12,000 rpm
离心
10
分钟,上清和沉淀分别进行
SDS-PAGE
电泳,以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。
(二)
超声波裂解菌体法
1.
单菌落接入
4 ml LB
培养液中,过夜培养。其中
2 ml
过夜培养物用于菌种保存和
DNA
测序,另外
2 ml
过夜培养物接入
100 ml LB
培养液中扩大培养。当
OD
600
为
0.6-0.8
时,加
IPTG
诱导表达
3-4
小时。
2.
4
℃
,
5,000 rpm
离心
10
分钟收集菌体,用
5 ml Binding buffer
充分悬浮细胞,超声波破碎细胞(功率:
120 W
左右,间歇时间:
10
秒,工作时间:
3
秒,破碎次数:
40-50
次)。
3.
吸取
20
μ
l
加入一洁净的
EP
管中,
12,000 rpm
离心
10
分钟,上清和沉淀分别进行
SDS-PAGE
电泳,以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。
(三)
SDS-
煮沸裂解菌体法
1.
单菌落接入
4ml LB
培养液中,
37
℃
培养。当
OD
600
为
0.6-0.8
时(约需
3-4
小时),吸取
2 ml
加入另一空的培养管中。其中,一管加
IPTG
诱导,另一管不加
IPTG
作为对照。
2.
吸取
1 ml
培养物加入洁净的
EP
管中,
10,000 rpm
离心
1
分钟收集菌体。在菌体管中加
20
μ
l
水和
20
μ
l 2
×
loading buffer
,沸水浴中维持
3-5
分钟。
3.
用
SDS-PAGE
电泳分析上述样品,以判断靶蛋白质在大肠杆菌中的表达量。
分
该帖子已被
版主-zhang8826857
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