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检测外源蛋白质在大肠杆菌中的表达

省部重点实验室

2012/10/02

生命科学仪器综合讨论

如果靶基因亚克隆在含有T7启动子的表达载体（如质粒载体pET-22b和pET-15b等）上，那么重组质粒应转化入λDE3溶源菌菌株 [如BL21(DE3)、JM109(DE3)及Qrigami B(DE3)等] 中，以进行靶基因的表达。

（一）溶菌酶-DNase I-反复冻融裂解菌体法

1. 单菌落接入4ml LB培养液中，过夜培养。再以1:20转接至2管4 ml LB培养液中，当OD₆₀₀为0.6-0.8时，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作对照。

2. 离心收集菌体，每管加Binding buffer 100 μl，DNase I (2,000 u/ml) 10 μl，溶菌酶 (2 mg/ml) 5 μl。菌体充分悬浮后，在-20℃放置20分钟，室温融化，如此反复冻融8-10次。

3. 吸取20 μl加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。

（二）超声波裂解菌体法

1. 单菌落接入4 ml LB培养液中，过夜培养。其中2 ml过夜培养物用于菌种保存和DNA测序，另外2 ml过夜培养物接入100 ml LB培养液中扩大培养。当OD₆₀₀为0.6-0.8时，加IPTG诱导表达3-4小时。

2. 4℃，5,000 rpm离心10分钟收集菌体，用5 ml Binding buffer充分悬浮细胞，超声波破碎细胞（功率：120 W左右，间歇时间：10 秒，工作时间：3秒，破碎次数：40-50次）。

3. 吸取20 μl加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。

（三） SDS-煮沸裂解菌体法

1. 单菌落接入4ml LB培养液中，37℃培养。当OD₆₀₀为0.6-0.8时（约需3-4小时），吸取2 ml加入另一空的培养管中。其中，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作为对照。

2. 吸取1 ml培养物加入洁净的EP管中，10,000 rpm离心1分钟收集菌体。在菌体管中加20 μl水和20 μl 2×loading buffer，沸水浴中维持3-5分钟。

3. 用SDS-PAGE电泳分析上述样品，以判断靶蛋白质在大肠杆菌中的表达量。

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