省部重点实验室
第1楼2013/02/20
6、 大肠杆菌转化实验
有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上,BL21就长得快),下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基),50微升酚/氯仿悬浮菌体,放置两分钟,加40微升TE抽提,上层TE吸出后再氯仿抽提一次,吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作,可以省去转接液体试管的培养步骤,至少节省6~8小时的时间。但是,要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果,不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。
转化时一定要做一个宿主菌的对照,即重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板,以确定第二天长出来的克隆是否正确,我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于BL21可以在Amp(+)的平板上面生长。
7、 蛋白质的表达、分离、纯化
当蛋白大量的表达时,包含体的形成几乎是不可避免的,而且很难通过改变一些诱导条件来改变,最有效的办法就是换表达系统,所以如果时间还充分的话,可以尝试一下,如果时间较短了,还是安心的座包含体蛋白的处理算了,而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到60%以上。
8、 PCR扩增产物的克隆
引物设计主要是要注意以下几个事项:
(1)发夹结构;
(2)反向配对;
(3)GC含量(40-60%);
(4)退火温度(45-65度);
(5)引物长度(18-27bp);
(6)3' 端最好是C、G(提高结合度);
(7)引物在序列中的错配位点。
大致就这几个方面,重要性依次降低,由其是3' 端绝对不能形成发夹结构。
那么你说你这段能不能设计引物呢?其实设计引物都只是好中选优的问题。
9、 细胞冻存和复苏实验
(1)可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里,拧松瓶盖,放到孵箱里半小时到1小时,这样温度和ph值都已经最适合细胞生长了。
(2)为防止冻存管在升温时爆裂等,可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间handle这些。只不过一旦细胞化了,就应该争分夺秒地把它放入培养液了,主要是为了稀释DMSO。常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。
(3)水浴温度40℃应该也没问题,但正规的protocol上从来都只说37℃。反正应该相差不大,但不能太高了。另外,不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过1.5分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里,再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里,余下的冰块瞬间就化了,再一起吸到培养瓶里。
10、 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
(1)RT-PCR有两种做法
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。
(2)RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
(3)RACE
我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故。