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第1楼2013/08/28
1实验部分
11材料
(1)黑土:于2009年10月,采自吉林农业大学校区长伊公路东侧台地耕层土壤(N43°48′44″;E125°23′45″),该地块长期单一种植玉米,有机质、全氮、全磷分别为17.58,1.1,0.71g·kg-1,pH 值为6.27。
(2)有机物料:小麦秸秆采集地与上述地块相邻,秋收后,将其剪成适当大小,在50~70℃条件下烘干,经粉碎过0.25mm筛,其有机碳、全氮、H 含量分别为416.4,8.2,7.2g·kg-1和C/N比78。
(3)菌悬液配制:供试菌株均源于供试黑土,经分离、纯化、扩培和刮取后制成一定浓度的菌悬液。细菌悬液由枯草芽孢菌和巨大芽孢杆菌组成,放线菌悬液由孢囊链霉菌和链霉菌组成;真菌悬液由木霉、青霉和黑曲霉组成。
1.2微生物培养及腐殖质组分的提取
1.2.1微生物培养
称取过2mm筛的黑土7.5kg,按土重4%加入麦秸粉末,混合均匀后,用硫酸铵调节C/N 比约为20(促使微生物发挥最大活性),按每瓶50g土分装至100mL三角瓶中,调节土壤含水量至田间最大持水量的70%~80%,加棉塞后进行间歇式灭菌,直至灭菌彻底。实验共设5个处理:(A)接种细菌悬液;(B)接种放线菌悬液;(C)接种真菌悬液;(D)将上述细菌、放线菌和真菌悬液按等比例混合,制成混合菌悬液后接种;上述A~D处理悬液接种量均为每瓶10mL;(E)无菌,仅加10mL无菌水。上述处理均设三次重复,培养实验在28℃条件下进行,定期称重补水确保混合物含水量恒定。180天培养后,取样,50℃烘干、磨细、备用。
1.2.2WSS,FA和HA的分离及提取
(1)WSS:将过1mm筛的100g风干土按土液比1∶10的比例,室温下置于玻璃瓶中,N2 条件下提取24h,将提取液用虹吸法吸出,提取液即为WSS。
(2)FA和HA:经蒸馏水除去WSS和水浮物后的土壤样品,用0.1mol·L-1 NaOH+0.1mol·L-1Na2P2O7 混合液在70℃条件下提取1h,提取液即为可提取腐殖质(HE)。该提取液经0.5mol·L-1H2SO4 酸化至pH1.0,溶液即为粗FA,沉淀为粗HA。将粗HA 沉淀用1∶1HCl调至pH7.0,高速离心去除粘粒,反复溶解两次后注入半透膜中透析,待AgNO3检测仅出现少量白色沉淀后转入电渗析仪中,至电流很小且阴极室无酚酞反应为止。将渗析纯化好的HA溶液进行旋转蒸发缩小体积,然后转入塑料烧杯中,置于冷冻干燥机中冻干,即可得纯HA 固体样品。将粗FA 溶液通过铺于布氏漏斗的活性碳层(活性炭用0.5mol·L-1 NaHCO3 溶液多次淋洗,再用水洗近中性),待渗出液无色后,弃去滤液,再用0.2mol·L-1 NaOH 溶液洗涤活性碳层,洗脱出的物质即为FA,再将FA组分用1:1HCl调至中性,经渗析、浓缩、冷冻干燥后即得纯FA固体样品。
1.3光谱实验
将冻干后的WSS,FA和HA 样品,用KBr压片,在美国NicoletAV360红外光谱仪上进行测定,波数范围为4000~400cm-1,分辨率为4cm-1,扫描次数为16,谱图采用OmnicVersion4.1软件包进行分析。
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2结果与讨论
2.1不同微生物处理对黑土犠犛犛的影响
由图1可知,经不同微生物培养的土壤样品,其WSS组分的红外谱图与空白间存在较大差异,尤其在指纹区(1800~900cm-1)差异更为显著,可见,外源添加微生物对WSS组分的特征峰及其吸收强度可产生重大影响。
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2.2不同微生物处理对黑土犉犃的影响
如图2所示,土壤FA经微生物培养后,无论是峰位还是吸收强度均无明显变化。1720和1430cm-1吸收峰,前者代表羧酸的C-O 振动,后者代表COOH的C-O伸缩和O-H 变形振动以及苯酚C-O 的伸缩振动,而1600cm-1附近的吸收峰是由于芳香结构的C寥/font]C 振动和氢键结合共轭酮的C寥/font]O 振动所引起的,1230cm-1处峰既可代表芳基醚和酚类的C-O振动,也可代表羧酸的C-O 伸缩振动和O-H 变形振动,1080~1030cm-1区间内的吸收峰应归属于多糖的C-O伸缩振动。
由表2可知,土壤FA 组分3400cm-1吸收峰在接种微生物培养后强度均有不同程度降低,降幅由大到小依次为放线菌>真菌>细菌>混合菌,表明放线菌在减少土壤FA 组分中羟基含量的能力最大,其次为真菌,混合菌最弱。Chai等采用红外光谱法研究填埋厂垃圾中所提取的HS组分,发现FA 在填埋过程中,脂族C-H 的伸缩振动(2940cm-1)和羧基的C寥/font]O 振动(1720cm-1)均有降低趋势,而1650cm-1处吸收峰强度有所增强,由此可知:FA组分中的羧基可被微生物酶及其氧化作用分解为小而多的FA 分子的子单位,而这一结论恰好与本文结果相悖,这表明在本研究中FA在分解的同时又被合成,WSS合成或HA分解所形成的新的FA 分子可部分掩饰原有FA 分子的分解过程。真菌培养土壤的FA 组分2920和1720cm-1峰面积增幅最大,而1600cm-1峰面积降幅最大,说明真菌对土壤FA 组分的“净生成能力”最强。另外,真菌处理土壤FA 组分2920和2850cm-1两峰吸收强度均有所提高,说明此时FA 组分正发生脱聚合作用[9],这与外源添加麦秸的腐解有关。FA 组分1720cm-1 的尖锐吸收峰,表明其结构中含有大量羧基。接种微生物培养后,FA 组分1720cm-1吸收峰均有不同程度增强,依次为C>B>A>D,由此可见,真菌培养后土壤FA组分的羧基含量最多,其次为放线菌,混合菌影响最小,但其FA组分中羧基含量仍略高于空白。真菌培养土壤的FA组分1034cm-1的吸收峰强于其他各处理,表明FA分子中含有较多碳水化合物结构,其次为混合菌,细菌处理影响最小。由1034/2920比值结果可知,细菌、放线菌和真菌培养均有利于土壤FA组分中多糖的降解和脂类的分解,而混合菌的作用恰好相反。
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2.3不同微生物对黑土犎犃的影响
如图3所示,不同微生物处理土壤HA组分的红外谱图与空白相比,在指纹区峰强度略有变化。以空白为例,3400cm-1宽峰的出现是由于酚基、羟基或羧基的O-H 振动引起的,2925~2850cm-1范围内的吸收峰依照Filip等的解析,应归属于脂肪族化合物CH3 和CH2 的C-H 伸缩振动,1720cm-1峰是因羧基、醛和酮的CO 振动所致,羧酸COO- 的非对称振动致使1620cm-1吸收峰振动强烈,1425cm-1吸收峰与COO- 和O-H 变形的对称振动及酚类C-O的振动有关,1230cm-1附近的峰应归属于芳香基团的C-OH 振动或芳基醚、酚类的C-O-C 振动,1122cm-1峰由脂族O-H 的C-OH 振动所引起的,多糖与类多糖物质C-O的存在可引起1034cm-1峰的出现。不难发现,HA组分红外谱图中未见1650(amideIband)和1540cm-1(amideIIband)两吸收峰,这表明HA 组分中蛋白质和缩多氨酸含量极微,通常情况下,淋溶强度较大的砂质土壤HA组分易出现此类状况,而本研究也许是因为湿热灭菌促使土壤HA组分中可溶性化合物损失所致。
由表3可知,经细菌、放线菌和真菌处理后的土壤HA分子中2920和2850cm-1两吸收峰的振动强度减弱,表明三个处理均有降低土壤HA组分中脂族含量的作用。肖彦春等研究认为2920/1720比值为2920和2850cm-1处峰面积之和与1720cm-1峰面积的比值,其值可用于衡量脂肪族含量的多少,D处理HA组分的2920/1720比值最大,且高于空白,而其他三个处理2920/1720的比值均小于空白(大小顺序为A>B>C),这表明混合菌培养土壤HA组分的脂族性变强,而细菌、放线菌和真菌均有利于HA 组分的脂族性变弱,其中真菌处理HA组分的脂族结构含量最少,即真菌对HA组分中脂族结构的消耗作用最大。
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3结论
经微生物培养的混有麦秸的土壤样品,其WSS的红外谱图在指纹区差异较大,表明微生物对WSS的结构和官能团数量的影响较大,氨基化合物和芳基醚可被微生物迅速降解,WSS的羟基含量可被微生物有效减少,其中,真菌对羟基的消耗最小,而放线菌对其消耗最大。经细菌培养,土壤WSS含有较多脂肪族烷烃类物质,而该类物质经放线菌、真菌和混合菌处理后均有减少趋势,减少幅度最大的为混合菌
处理。放线菌对WSS中酚类物质的消耗最大,而真菌对其消耗最小。接种微生物有利于提高土壤WSS中羧基的数量,其中细菌和放线菌的作用较大。微生物在培养过程中可消耗WSS中几乎全部的多聚糖,尤其是混合菌处理。
放线菌在减少土壤FA组分中羟基含量的能力最强,其次为真菌,放线菌最弱。WSS合成或HA 分解所形成的FA分子可掩饰原有FA 分子的分解,其中,真菌对土壤FA 的“净生成”能力最强。脱聚合作用发生在真菌处理土壤的FA中。经真菌培养后的土壤FA 中羧基含量增幅最大,其次为放线菌,混合菌最少,但仍高于空白。另外,真菌有利于提高FA分子中碳水化合物的数量,其次为混合菌,细菌处理最小。除混合菌外,细菌、放线菌和真菌均有利于土壤FA中多糖的降解和脂类的分解。
在HA方面,湿热灭菌易导致其缺失1650 和1540cm-1两处吸收峰。细菌、放线菌和真菌均有利于降低土壤HA中脂族的数量,其中真菌处理HA 的脂族结构含量最少,而经混合菌培养后的土壤HA 脂族性变强。此外,真菌可有效促使土壤中HA 羧基含量的增加,而细菌作用相反。供试微生物可消耗和利用HA中的多糖类物质,其中混合菌的消耗量最大。微生物的存在可有效促使植物残体类腐殖质向土壤成熟腐殖质转化。