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琼脂糖凝胶电泳常见问题与解决办法
省部重点实验室
2013/12/26
私聊
生命科学仪器综合讨论
一、凝胶制备
1.
微波炉溶解琼脂糖时,胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾,
(
1
)总液体量不宜超过三角锥瓶的
50%
容量。
(
2
)
2%
以上胶液设置中火加热。
(
3
)胶液剧烈沸腾时,停止加热,移开三角锥瓶,请戴上防热手套,小心摇动三角锥瓶,然后再次加热,胶液沸腾直至胶液清澈,保证琼脂糖完全溶解。
2.
琼脂糖电泳图像背景模糊不清:琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。完全溶解的琼脂糖胶液清澈,三角锥瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。
3.
加热后水分蒸发,如需要应加入热的蒸馏水,补足到原来的重量,摇匀。
二、电泳
1. DNA
条带模糊,拖尾。
(
1
)
DNA
降解。避免核酸酶污染。
(
2
)
DNA
上样量过多。减少凝胶中
DNA
上样量。
(
3
)电泳缓冲液陈旧
:
电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,
pH
值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
(
4
)电泳条件不合适。电泳时电压不应超过
20 V/cm
,温度<
30
℃
,
巨大
DNA
链,温度应<
15
℃
,核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
(
5
)
DNA
样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
(
6
)有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。
(
7
)
DNA
变性。电泳前勿加热,用
20 mM NaCl
缓冲液稀释
DNA
。
2. DNA
条带淡弱或无
DNA
带。
(
1
)
DNA
的上样量不够:增加
DNA
的上样量。
(
2
)
DNA
降解:避免
DNA
的核酸酶污染。
(
3
)
DNA
走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。
(
4
)分子大小相近的
DNA
带不易分辨。增加电泳时间,使用正确的凝胶浓度。
(
5
)
DNA
变性:电泳前请勿高温加热
DNA
链,用
20 mM NaCl Buffer
稀释
DNA
。
(
6
)
DNA
链巨大,常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。
3. DNAMARKER
条带扭曲。
(
1
)配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面
1~2 mm
即可。
(
2
)电泳时电压过高。可以在电泳前
15
分钟用较低电压(
3 V/cm
),等条带出孔后,再调电压。
(
3
)尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。
分
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