在实践中探索的检测方法

在实践中探索的检测方法

我们实验室最近新上了一个检测项目，高效液相色谱法检测红曲中桔青霉素含量。这个好多人可能也做过，其实也不难，但做的过程却并不那么顺利。

这是一个企业新上的项目，他们做了很长时间也没做好，后拿到我们实验室，联手开发新方法。

一开始是他们仪器安装的问题，新买进口的荧光检测器，没接地线，噪声特别大，有2mv，比正常的大了40-80倍。含量较低的样品，基本检不出，或检测结果与真实值相差较大。后接上地线，噪声好了，却又发现色谱峰不仅较宽，拖尾也很严重（噪声大的时候，看的不明显），一是不好看，二是不准确。

后把标准品、样品和色谱柱一块拿到我们实验室，进行合作。

我们一开始做的也不顺利，不过还好，最后总算做出来了，而且效果很好，我们很满意，客户也很满意。下面就介绍下检测过程和检测结果吧。

实验部分

仪器

高效液相色谱仪：配荧光检测器，自动进样器，柱温箱

超声波振动仪

超声波细胞粉碎仪

电子天平：0.0001g级

PH计：精度0.01

匀浆机

离心机

旋转蒸发仪

溶剂过滤器

恒温水域

涡旋振动器

磁力搅拌器

试剂

乙腈：色谱纯

甲醇：色谱纯

磷酸：分析纯

甲苯

乙酸乙酯

甲酸

无水乙醇

超纯水

桔青霉素标准品

样品前处理主要是按国标GB/T5009.222-2008方法处理的，倒也简单。

色谱条件

色谱柱：STC-C18色谱柱

流动相：乙腈：水（磷酸调PH值至2.5）=65:35（V:V）

流速：1.0ml/min

检测波长：激发波长331nm,发射波长500nm

进样量：10ul

柱温：30℃

色谱图

标准品色谱图：

样品色谱图：

按这个色谱条件做，色谱峰较宽，拖尾严重。这正是我们要改进的工作的重点。

有人说改变流动相PH值可以调节色谱峰形，建议尝试下。于是我们先把流动相中水的PH值调到2.4，基本无变化；调到2.6，基本无变化；后依次调到2.3、2.7、2.2、2.8、2.1、2.9、2.0、3.0，但色谱峰形仍然基本无变化。

看来流动相PH值对色谱峰形影响不大，改变这个状况靠调节PH值不行。

于是又有人建议加大流动相中乙腈含量，这样出峰时间就短，峰就会窄，峰形可能就会好些。于是我们把流动相改成乙腈：水=75:25。结果出峰时间是短了，色谱峰也窄了，但峰拖尾依然较严重。而且这样做的话杂质峰影响到了桔青霉素的峰（杂质峰和桔青霉素峰分离度差了）。看来靠调节流动相是解决不了问题的。

我们经过一番热烈的讨论后，大多人觉得流动相PH值较低，用更耐酸性的色谱柱，效果可能会好些。于是我们找来一根更耐酸性的ASB-C18色谱柱，250X4.6mm，5um。结果出峰时间22.3min，色谱峰较宽，但峰拖尾现象好了很多，基本不明显了。

标准品色谱图：

只是出峰时间长了些，峰宽了些。这个问题还得解决，不过相对好解决多了。

首先我们调整了下流动相，乙腈：水=75:25，出峰时间13.6min，峰也窄多了，拖尾现象基本不存在了，这样问题解决。

标准品色谱图：

样品色谱图：

下面我们又做了第二套方案，那就是流动相还是乙腈：水=65:35，色谱柱选的仍然是ASB-C18色谱柱，只是长度是150mm，其它的不变。结果出峰时间14.8min，峰也很窄，拖尾现象基本不存在。

色谱图：

样品色谱图：

这种方法也是解决这个问题的好方法，并且优点更多，一是流动相中乙腈（较贵）含量低，省钱；二是色谱柱短，便宜；三是压力低，系统适应性更好。

这样我们就完活了。我们为客户提供两套解决问题的方案，其中第二套更理想，客户很满意。

色谱柱是液相色谱的核心，在液相色谱中起着超乎寻常的作用。大家实验时如果碰到类似以上问题时（实际很多问题都是由色谱柱引起的），不防换根色谱柱试试。色谱柱选合适了，你的实验可能就成功一大半了，尤其是开发新方法。

色谱柱选好了，我们做实验会准确、快速、省时、省力、开心、愉快！

色谱柱常识大家最好了解些，尽量让它成为我们实验的助手、帮手，而不是碍手。