方法优化中的理论和实践

方法优化中的理论和实践

很多事情的运作直至成功都离不开强大的理论指导，但光有理论指导却不一定能成功，实践也很重要，实践也是成败的一大重要因素。

理论指导实践，实践验证理论，二者相辅相成，二者同样重要。

下面我们就用一件事来阐述一下二者的关系吧。

前一阵我们接到一个样品，是一个蜂胶检测的样品，客户自己也有仪器，但检测效果不理想（客户之前做的样品还行，可能是这批样品有些特殊，检测结果不理想），于是拿到我们这，希望我们能帮着把这个样品做出来，并且提供做出该样品的方法。

该样品是蜂胶样品，样品中的主要成分和含量客户要求保密，我们在这就不明确了，希望大家能够理解。方法是高效液相色谱法，下面就具体介绍下。

实验过程

客户提供了检测方法和配制好的标准品及样品，另外又带了些蜂胶成品。

仪器

高效液相色谱仪（等度+紫外检测器+柱温箱），超声波振动仪，溶剂过滤器，进样器，固相萃取仪，离心机

试剂

甲醇（色谱纯），超纯水，磷酸

色谱条件（客户参考标准的方法）

检测器：紫外检测器

色谱柱：C18，5um，4.6 X 250mm

检测波长：270nm

流动相：甲醇：0.1%磷酸=58:42（V:V)

流速：0.8ml/min

柱温：室温

进样量：20ul

标准品色谱图：

样品色谱图：

通过以上色谱图我们可以看出几个问题：一是标准品和样品峰形都不好，分离度也很差，但客户需要的是6号峰、7号峰和8号峰样品的含量，所以客户能接受标准品色谱图效果而接受不了样品的效果；二是标准品和样品的峰高都很高，这说明标准品和样品的浓度都很高；三是检测时间太长了，这个客户也要求尽量缩短。

客户之前自己做的，为了缩短检测时间，用的流动相是甲醇：0.1%磷酸=70:30（V：V)，色谱图如下：

标准品色谱图：

样品色谱图：

这个检测时间是短了些，但分离度却更差了。

按客户的要求，下面需要我们做的最主要的是提高样品中6号峰和前面物质的分离度，其次是尽量缩短检测时间。

样品浓度这么大，分离度肯定受影响，按我们平时检测的经验，色谱峰高在10mV-500mV效果较好，于是我们先取出适量标准品和样品，分别稀释了10倍进样，流动相是甲醇：0.1%磷酸=70:30（V：V)，色谱图如下。

标准品色谱图：

样品色谱图：

分离度好了很多，但还是不太好。接下来我们又重新配制了样品，客户配制样品的过程是样品加水溶解，微膜过滤。我们在样品配制过程中又加了离心和固相萃取两步。结果效果和原来差不多，我们不知道6号色谱峰前面的干扰物是什么物质，固相萃取柱不好选择，这可能也是实验失败的重要原因，看来这种方法行不通。

下面我们考虑到改变下检测波长会不会通过干扰物和6号峰对每个波长的响应值不同来提高分离度，于是分别采用260nm和280nm进行检测。结果260nm时6号色谱峰前面那个干扰物和7号色谱峰变大了，6号色谱峰却变小了，其它的色谱峰基本不变；280nm时大多色谱峰都变小了，包括6号色谱峰和前面干扰物色谱峰。

通过上面的实验我们可以得出改变检测波长后，6号色谱峰和前面干扰物的分离度更差了，这种方法也是行不通。下面我们又分别把进样量由20ul改为10ul、5ul，色谱图如下。

进样量10ul标准品色谱图：

进样量10ul样品色谱图：

进样量5ul标准品色谱图：

进样量5ul样品色谱图：

到此效果已经有很大的改观了，尤其是5ul的进样量，那下面就用5ul的进样量了。但为了进一步提高分离度，我们又改变了一下流动相，以甲醇：0.1%磷酸=65:35（V：V)为流动相，色谱图如下。

标准品色谱图：

样品色谱图：

这样分离度已经很好了，完全满足客户要求，但客户觉得检测时间有点长，最好再优化下。于是我们首先把泵流速由0.8ml/min改为1.0ml/min，色谱图如下。

标准品色谱图：

样品色谱图：

这样检测时间缩短了一些，并且对分离度影响不大，这一变化收益不小。下面我们又提高了色谱柱温度，分别选了30℃、35℃，色谱图如下。

30℃标准品色谱图：

30℃样品色谱图：

35℃标准品色谱图：

35℃样品色谱图：

通过以上色谱图我们发现色谱柱温度控制在30℃时对分离度影响不大，检测时间也略缩短了些。客户对这个检测结果非常满意，这样新的检测方法诞生了。

色谱条件

检测器：紫外检测器

色谱柱：C18，5um，4.6 X 250mm

检测波长：270nm

流动相：甲醇：0.1%磷酸=65：35（V：V)

流速：1.0ml/min

柱温：30℃

进样量：5ul

为了提高这个样品的分离度，我们做了很多优化检测方法工作，有的效果明显，有的不明显，下面总结如下：

1.稀释样品；

2.减少进样量；

3.减少流动相中有机相含量；

4.改变检测波长；

5.优化前处理方法。

其中前三项效果较好，后两项在这个检测中效果一般（根据经验，这两项在有些检测中，也有很好的效果）。另外有时通过降低泵流速、降低色谱柱温度、更换效果更好的色谱柱等方法也能获得很好的效果。当然通过以上这些工作我们也得出了缩短检测时间的几种方式。那就是：一是增加流动相中有机相含量；二是提高色谱柱温度；三是增加泵流速。当然换一根柱效更高的色谱柱也是很好的选择。

提高分离度理论方法有很多，但实践证明有的可行有的不可行，最后理论加实践获得了比较好的结果。

理论、实践二者相辅相成，二者同样重要，缺一不可。

理论指导实践，实践验证理论，并有可能产生新的理论，这应该就是理论和实践的关系吧。