兜兜转转-离奇的色谱柱故障排查

以渔

2015/07/07

私聊

液相色谱（LC）

楼主在一家第三方的检测实验室工作。这次要讲的是安家的液相色谱。
六月底，接到同事的通知，说偶氮的谱图很难看，光谱也很难匹配。
首先上液相条件

Parameters	HPLC-DAD (Agilent 1200)
Acquisition Mode	Signal channel:240nm, 280nm ,304 nm
Injection Volume	15 ul
Column	Zorbax SB-phenyl , 5um , 4.6mm*250 mm
Column Temperature	40℃
Flow Rate	1 ml/min
Gradient Program	Time	Mobile Phase (A) 10mM NH4H2PO4& 10mMNa2HPO4	Mobile Phase (B)- Methanol
	0.00	90%	10%
	9.00	75%	25%
	22.0	60%	40%
	26.0	40%	60%
	34.0	0%	100%
	37.0	0%	100%
	37.5	40%	60%
	38.0	60%	40%
	38.5	75%	25%
	39.0	90%	10%
Total Run Time	45 min

上图

初步判断是色谱柱有问题。询问发现色谱柱换上去没几个月，有可能是上个样品太脏了，建议观察下看继续走样能恢复不。
26号早上，看到25号走的样品还是很不好看。实验员找我清洗下泵头。遂拆泵，稍微擦掉里面的些许黑色密封垫碎屑和出口单向阀。超声入口单向阀。
依然不好看。同时被告知每一种物质的保留时间比最开始的时候都往前移了5分钟。

保留时间往前提了5min，这是一个很严重的问题。怀疑色谱柱坍塌，流动相配置错误甚至是比例阀失灵。
之前被告知色谱柱是刚换没几个月，就没往这个上面去深追。询问流动相的配置员-老人一个，基本没可能出问题。
故周末6月30日过来检查比例阀。
参照JJG_705-2002_液相色谱仪检定规程，配置0.1%的丙酮水溶液，分别检查AB通道，CD通道的比例阀。
得到跟检定规程相似的梯度。比例阀完全没问题。那真正的问题在哪里。

同日，再走样品。完全不能看了，光谱图更差劲了，标准品都走成这样，那样品该怎么办。

七月。在论坛上看到一个帖子，说色谱柱接头处有可能会脏。检查后更换。
跟6月底的差不多，但这不是我要的结果。

6号，彻底恼怒了。色谱光谱都不能见人。

回到最初的怀疑，色谱柱真的不行了。把之前的色谱柱拆下来，看下里面是不是真的如我猜测的那样，柱头坍塌了。
把之前报废的一根柱子拆开，果然是这样的。柱头坍塌大概1cm。再拆开几个月前刚启用的柱子，也是坍塌了1cm。
难怪保留时间和柱效出大问题。

开始询问安家客服。得到的回复是：这个是ZoBrax SB的苯基柱，在pH=7,柱温40度左右，很不稳定。
长时间这样使用，柱子容易坍塌。建议降低流动相的pH值和柱温。
同时查阅这根柱子的说明书，上面写着
StableBond colums are designed for high stablity at low pH(eg pH<4). However, all silica-based packings have some solubility in pH>6 aqueous mobile phases.
therefore when using silica-based columns under condition of pH>6, maximum column lifetime is obtained by operation at low temperatures (< 40 Centidegree) using low buffer concentrations in the range of 0.01 to 0.02M.
这都是没认真看柱子的说明书惹的祸。
重新换根新柱子，降低柱温.
峰形又回来了，保留时间正常了。