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“呕吐毒素”测定过程中的“呕吐”经历

夏天的雪

2016/09/20

私聊

液相色谱（LC）

“呕吐毒素”测定过程中的“呕吐”经历
声明：本文为吐槽贴，而非中毒贴，想看中毒经历的请绕行！
1 前言
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又称呕吐毒素，是镰刀菌属禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等的次级代谢产物，是一种常见的真菌毒素，其广泛存在于小麦、大麦、玉米等粮食作物中。人和动物长期大量摄入DON后会抑制蛋白质的合成，造成呕吐、腹泻、厌食、恶心、神经紊乱等毒性效应。DON的性质十分稳定，烘焙、高温、高压等食品加工方法对它的影响很小，120℃的高温仍然不能使其降解，当温度升高到210℃处理30～40 min才能被破坏。为减少DON对人类的危害，目前很多地区和国家都制订了相应的标准来限制粮食中DON的含量，《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》标准中规定谷物及其制品中DON的限量为1000μg/kg。

粮食中DON的检测方法主要有胶体金快速测试法、酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相色谱法以及液相色谱-质谱/质谱法。GB 2761-2011推荐谷物及其制品中DON按GB/T 23503规定的方法测定，即用提取液提取试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，经免疫亲和柱净化后用高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。于是参照标准要求准备和采购相关的试剂、标准品和免疫亲和柱，然而测试的过程却是一波三折，煞费苦心。
2 实验部分
2.1仪器分析条件—参照GB/T 23503-2009标准方法
色谱柱：C18 (250mm×4.6mm ,5μm)；流动相：甲醇：水=20:80；流速：0.8mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；检测波长：218nm
2.2 样品前处理—参照呕吐毒素免疫亲和柱说明书

3 遇到的问题与分析
实验中与标准中所用的色谱柱规格不一致（标准中色谱柱规格：C18柱,250mm×4.6mm , 5μm），可能导致分析时待测物质的保留时间、分离度等产生差异，因此对标准品进行稀释并按照上述分析条件进行测试(标准品浓度为200μg/mL，稀释后的标准溶液记为标准溶液A)，测试结果如下。

10μg/mL的标准溶液色谱图中出现了两个具有较高响应的色谱峰，且峰型、分离度均较好，顿时有点茫然，仿佛出现了“真假美猴王”，不知道哪个才是DON的色谱峰。对标准溶液继续稀释，在低浓度的时候发现组份1容易被试剂或其它组分干扰，而组份2几乎没有什么影响，而且在做标准曲线的时候发现组份2的峰面积与浓度有很好的线性关系，如图4，于是就将组份2默认为DON的色谱峰。

“理想总是很美好，现实却是很悲惨”，在方法验证的过程中遇到了难题，加标样品按照上述流程进行前处理后，上机测定的色谱图中“一贫如洗”，没有出现组份2的色谱峰，也没有组份1的色谱峰。难道是样品中添加的DON浓度太小，低于检出限了？增大加标浓度，结果与之前一样还是没有检出。难道是提取的问题？为了验证这一想法，直接用水提取加标小麦粉中的DON，测定色谱图中组份1和组份2又“重出江湖”，并且组份2有很好的回收率。

排除掉提取的原因后，继续排查免疫亲和柱的柱效。取1mL浓度为2μg/mL的标准溶液直接过免疫亲和柱，分别用1mL的水和甲醇进行淋洗和洗脱，收集过柱后的标液、淋洗液和洗脱液并上机测试，测定结果如下图。

测试结果表明，标准溶液经过免疫亲和柱时大部分待测物质与填料都是“擦肩而过”，少量保留在填料中的DON也被水给“洗刷”了下来，最后用甲醇洗脱时不见了DON的踪影。本以为是免疫亲和柱出了问题，因为按照说明书要求，免疫亲和柱要于“2-8℃冷藏保存，不可冷冻”，虽然买回来就进行了冷藏，但不能保证运输途中温度也符合保存要求。重新购买免疫亲和柱，有了上述的“前车之鉴”，觉得采购这东西还是不要“舍近求远”，联系当地的经销商，经过沟通了解到他们代理的免疫亲和柱与原先使用的品牌不一样，但能提供试用柱。于是决定先试用再购买，第二天销售人员亲自送来了两根试用柱，免疫亲和柱装在离心管中并有冰袋保持环境的温度，销售人员送来的时候冰袋都还没有完全解冻。由于只有两根试用柱，使用的时候还是很小心翼翼的，直接用标准溶液过免疫亲和柱，检查该款免疫亲和柱的性能，测试下来的结果与之前的结果同出一辙，看到结果时有点傻眼，也很茫然，联系两家的经销商都保证免疫亲和柱的质量没有问题。他们的免疫亲和柱没有问题，那我的问题出在哪了？后来在论坛中看到了相关的帖子，发现一丝端倪，有网友发帖阐述物质2并不是DON的色谱峰，而是溶剂乙酸乙酯的色谱峰，实验室对此进行了验证，果然，物质2的出峰时间和乙酸乙酯的出峰时间一致，而且查看标准物质证书发现，该标准品的介质正是乙酸乙酯。

既然物质2是乙酸乙酯，那么物质1就是DON吗？重新梳理测试过程和测试结果，对物质1是DON也产生了怀疑，原因在于物质1过免疫亲和柱的时候也没有能够产生保留。于是将疑点转移到标准品上，此次对标准品进行了更换，采购以乙腈为介质的标准品进行测试(标准品浓度为100μg/mL，稀释后的标准溶液记为标准溶液B)。测试前先用乙腈对标准溶液进行稀释，测试结果如下。

对比两份标准溶液的色谱图，相同分析条件下两者的测试结果截然不同，完全不像同一种物质的标准溶液，以乙腈为介质的标准溶液色谱图中虽然没有了物质2即乙酸乙酯的色谱峰，但是也没有物质1的色谱峰，而是在13min附近另出了一个色谱峰，该色谱峰峰型较差，似乎是与标准溶液中的干扰物质没有完全分离。不管该峰是不是DON的色谱峰，还是先对其进行分离，否则会影响定性和定量。先通过调节流动相比例进行优化，分离结果并不是很理想，然后将甲醇换成乙腈进行分离，此时完全不出峰，更换新的色谱柱也是一样的结果。

在分离条件优化的过程中再一次遇到难缠的问题：
（1）干扰物质与待测组份就是一对好朋友，无论怎么调节流动相，两者总是形影不离，不离不弃；
（2）以乙腈和水为流动相时干扰物质与待测组份同时消失；
（3）此次测试用的标准溶液浓度为20μg/mL，是标准中最大标准溶液浓度的4倍（标准中最大浓度为5μg/mL），虽然甲醇：水=15：85时干扰物质与待测组分有所分别，但是响应值很小，很难达到标准中方法检出限。
新买的标准品，新配的标准溶液，出峰出的如此难看，而且还有杂质干扰，于是打电话给经销商，经销商提供了标准品生产单位的联系方式，几经周转联系到了相关的技术人员。首先将检测过程中遇到的现象和疑惑告之对方，然后咨询对方是否遇到过类似情况，最后征询对方能否提供解决方案。对方果然见多识广，他们在实验过程中以及客户的反馈中均遇到过这样的情况，建议尝试用水对标准溶液进行稀释。真是不试不知道，试完真奇妙。用水稀释后的干扰物质消失了，同时峰的响应值也变高了很多，这就是传说中的溶剂效应。

标准溶液B用水稀释后解决了干扰和响应的问题，标准溶液A用水稀释会不会有变化呢，实验结果表明标准溶液A用水稀释前后几乎没有任何变化。
标准溶液B测试过程中的杂质干扰和峰响应问题得到了解决，但并不意味着标准溶液B中出峰的物质3就是DON。于是用标准溶液B过免疫亲和柱，看物质3是否会在免疫亲和柱上产生保留。
实验中采用的是1mL的免疫亲和柱，其柱容量的明示值为500ng的DON，为了防止免疫亲和柱的柱效差、回收率低而导致最终浓度低于仪器的检出限，上样时的标准溶液浓度远远大于免疫亲和柱的柱容量。收集过柱后的标液、淋洗液和洗脱液并上机测试，测定结果如下图。

此次测试结果与之前相比，标准溶液B过柱后的收集液以及淋洗液仍能检测出物质3的峰，不同的是甲醇的洗脱液也检测出了物质3的峰，该色谱峰的出现给测定过程带来了一丝希望。该色谱峰可能是物质3与免疫亲和柱中DON的抗体结合形成的保留，如果假设成立，物质3就是DON。过柱后的收集液和淋洗液中出现DON的色谱峰也不难理解，因为此次过柱的标准溶液浓度超过了免疫亲和柱的柱容量，饱和吸附后自然会流出柱外；淋洗前未对柱中的溶液进行吹干，多余的含有DON的标准溶液被水洗脱出来进入淋洗液中。当然，甲醇洗脱液中物质3的峰也可能是上样的标准溶液浓度太高，水未能对物质3完全淋洗而残留在甲醇的洗脱液中，这就需要进行下一步验证。过柱的过程按照1mL标准溶液（浓度为10μg/mL），1mL水淋洗，1mL甲醇洗脱的步骤进行，通过计算发现过柱后得到的物质3的峰面积之和（标准溶液B过柱后收集液、淋洗液和洗脱液）与过柱前的峰面积相近，另外通过计算得到该免疫亲和柱的柱容量大概为2.5μg，超过了说明书中的明示值。
为了进一步验证免疫亲和柱的保留能力和甲醇中物质3的来源，根据上述计算得到的柱容量，采用低浓度的标准溶液进行过柱（浓度为2μg/mL），测试结果如下图。

测试结果表明，免疫亲和柱对标准溶液B中的物质3均有很好的保留作用，以水为淋洗液能洗脱出微量的物质3，甲醇洗脱后物质3的回收率为95.84%。采用标准溶液B在另一根免疫亲和柱试用柱上进行测试，依然有很好的保留和回收率。结合上述的实验过程和免疫亲和柱的测定原理，基本判断标准溶液B中的物质3为DON，标准溶液A中的物质1究竟为何物，暂时不得而知。
重新将标准溶液B进行稀释并绘制标准曲线，以DON的峰面积对浓度进行线性拟合，DON在0.2-2.0μg/mL之间具有很好的线性关系。

确定了标准溶液B中物质3即为DON后继续对小麦粉样品进行测试。分别往小麦粉中加入低浓度和高浓度的标准溶液B（不能超过免疫亲和柱的柱容量），按照免疫亲和柱说明中的提取方法和操作流程进行提取、净化并上机测试，测试结果表明，该款免疫亲和柱对小麦粉中的DON具有很好的保留作用，该方法适用于小麦粉中DON的提取和测定，不同浓度的加标回收率均在95%以上。对比小麦粉加标样品过柱前后的色谱图，过柱后样品中杂质较少，同时免疫亲和柱对样品中低浓度的DON具有浓缩作用，有利于提高方法的检出限。

4 小结
(1) 免疫亲和柱的测定原理：免疫亲和柱的填料为含有和DON抗体结合在一起的凝胶，以抗体-抗原特异性反应为基础，当DON通过免疫亲和柱时，DON与抗体结合保留在柱中，其它物质不会结合从而直接流出，最后加入甲醇时DON被释放并洗脱。标准溶液A中的组份1和组份2均不是DON，不能与抗体结合，在过柱和淋洗阶段全部流出柱外；标准溶液B中组份3为DON，与抗体结合产生保留，用甲醇洗脱时DON被释放，符合免疫亲和柱的测定原理。
（2）标准溶液A中组份2已确认是乙酸乙酯，而组份1为何物？这是实验中仍存在的一个疑问。百度百科中提到“DON可溶于水和极性溶剂，具有较强的热抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯中可长期保存”，因此变质的可能性较小。
（3）免疫亲和柱说明书中标明：1mL免疫亲和柱的柱容量为500ng呕吐毒素，而实验中计算得到1mL免疫亲和柱的柱容量为2.5μg，远超过说明书中的明示值，而且采用含有2μgDON的标准溶液过柱时，依然有很好的回收率，因此标准品的浓度与免疫亲和柱的柱容量两者产生了矛盾，孰对孰错是这次实验的另一个疑点。

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