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缬沙坦清洁验证分析方法研究

高秋荣

2017/09/11

食品毒素/微生物检测

缬沙坦清洁验证分析方法研究
西安国联质量检测技术股份有限公司
食品事业部：淮瑞娟

试验方法：参照《中国药典》2010版（二部）中缬沙坦的分析方法。采用高效液相色谱法进行检测；色谱柱为TC-C18（150×4.6mm，粒径：5um）；流动相为乙腈-水-冰醋酸（500:500:1）；检测波长为225nm。理论板数按缬沙坦峰计算不低于4000。缬沙坦峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。
试验结果：缬沙坦对照品溶液在0.1006μg/ml~5.03 μg/ml范围内呈良好的线性关系，r=1.0000，加标回收率可达到79.0%。
结论：该方法操作简便、灵敏度高、专属性强，可用于缬沙坦清洁验证化学残留量的检测。
1、清洁验证方案提出的问题
通过多种方法计算和考察，最终采用常规限度法作为缬沙坦设备清洁验证化学残留浓度的确定方法，通过比较另外两个原料药中的表面残留限度标准，最终确定27.0μg/dm2为目标残留物缬沙坦擦拭取样限度。中国药典2010版二部采用容量法测定缬沙坦的含量，而27.0μg/dm²目标残留物限度容量法无法检测，因此考虑拟采用缬沙坦有关物质的方法——高效液相色谱法检测其化学残留物，但应进行分析方法学验证。同时考虑应做擦拭取样回收率考察擦拭取样方法的科学性和合理性
2、系统适应性
供试品溶液：取供试品50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀（0.5mg/ml）。
对照溶液：精密量取1.0ml供试品溶液，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取1.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀（0.5ug/ml）。
取供试品溶液和对照品溶液各10ul注入液相色谱仪，其中对照品溶液连续进样6次，记录色谱图。
在供试品溶液获得的色谱图中，缬沙坦峰的理论踏板数应不小于4000。在对照溶液获得的色谱中，6次进样缬沙坦峰保留时间的RSD不大于1.0%，峰面积的RSD不大于5.0%。
系统适用性检测结果

测定次数
1
2
3
4
5
6
RT（min）
6.288
6.288
6.288
6.288
6.288
6.288
RSD%
0%
峰面积
289385
289221
287769
286549
288336
287269
RSD%
0.39%
理论塔板数
10364

对照品溶液进样图谱
3、线性关系
取缬沙坦对照品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀得5ug/ml的缬沙坦对照品溶液。再精密量取本溶液，稀释得系列溶液（0.05~5ug/ml），分别取10ul进样测定，记录色谱峰及峰面积。以缬沙坦溶液浓度对峰面积进行线性回归计算，确认线性与范围。以标准溶液的浓度（ug/ml）为横坐标，其色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。缬沙坦对照品溶液在0.1ug/ml至5ug/ml呈良好的线性关系，线性方程为：Y=536360.6440X﹣552.1797（r=1.0000）。结果见图线性关系图。
对照品溶液浓度 0.1ug/ml进样图谱
4、定量限和检测限
4.1取线性范围测定项下线性最低浓度溶液（0.1ug/ml）10ul，注入色谱仪，记录色谱图，进样3次，信噪比S/N≧10即作为定量限浓度。对应检出限即为定量限。
取定量限浓度溶液稀释三倍溶液10ul，注入色谱仪，记录色谱图，进样3次，信噪比S/N≧2即作为检测限浓度。对应检出限即为检测限。
结果见表定量限和检测限结果，定量限为0.1006ug/ml，检测限为0.0335ug/ml。
表定量限和检测限结果

峰名
峰面积
峰高
信燥比
信燥比平均值
定量限
缬沙坦
56154
6144
11.6
11.9
0.1006μg/ml
51299
6190
10.9
55206
6343
13.2
缬沙坦
19120
2383
2.9
5.2
0.0335μg/ml
19988
2424
5.1
20752
2509
7.6

定量限进样色谱图

4.2精密度测定
取缬沙坦对照品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，再精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀得0.5μg/ml的缬沙坦对照品溶液。
取对照溶液10μl注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图，并计算其相对标准偏差为0.9%，结果表明方法精密度良好
精密度测定结果见表。
表精密度测定结果

测定次数 1 2 3 4 5 6
峰面积 299625 309036 305159 303396 298980 302492
RSD%
0.9%

精密度进样色谱图

4.3中间精密度测定
另一分析员不同天按精密度测试方法连续制备6份对照溶液，并统计计算6+6次测定结果的RSD。
取缬沙坦对照品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，再精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀得0.5μg/ml的缬沙坦对照品溶液。
取对照溶液10μl注入另一台液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图，并计算其相对标准偏差为2.9%，结果表明方法中间精密度良好。
表中间精密度测定结果

测定次数 1 2 3 4 5 6
峰面积 299625 309036 305159 303396 298980 302492
测定次数
7
8
9
10
11
12
峰面积
305859
284112
289258
289604
284005
282539
RSD%
2.9%

中间精密度进样色谱图

5.取样回收率
5.1方法描述：一块1.5dm×1.5dm平整光洁的不锈钢板；用钢锥划出1dm×1dm的区域；配制5倍限度量的缬沙坦对照品溶液，精密量取1 ml溶液用注射器尽量均匀地涂布在1dm×1d mm的区域内，自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板；用无水乙醇润湿棉签，按以下取样方法擦拭不锈钢板，擦拭后棉签置于干燥洁净的具塞试管中，加塞，加入流动相适量，超声洗涤，使缬沙坦溶出；按高效液相检测法，计算回收率和RSD。
5.2取样方法：将棉签头按在取样表面上，用力使其稍弯曲，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉签，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直(如图)。擦拭完后，将棉签放入具塞试管，密封。另取一棉签重复操作一次。
棉签擦拭取样示意图

第一步第二步
影响因素：进行擦拭取样试验时应注意擦拭工具和不锈钢板的干扰。常用的擦拭工具为棉签，棉签易吸附残留物，其上面的隐形残留物也易被溶剂洗脱，但棉签易脱落纤维，故在使用前应用溶剂预先清洗，以免纤维遗留在取样表面；不锈钢板应平整光洁，清洗干净用电吹风吹干后再涂溶液，以免取样不均匀和引进杂质，而产生较大的RSD。还应注意取样方式，应尽可能采用固定的力度、擦拭速度和线路，以免产生较大的RSD。
将不锈钢板清洗干净，同法重复三次。
5.3操作步骤
准备一块1.5dm×1.5dm平整光洁的316L不锈钢板。
分别在钢板上用钢锥划出1dm×1dm的区域。
取缬沙坦对照品约27mg，精密称定，置200mL量瓶中，加流动相适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀。
精密量取1ml溶液（约5倍限度量），用注射器尽量均匀地涂布在1dm×1dm的区域内。
自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板。
取八支棉签，用无水乙醇浸泡棉签30分钟。
取出棉签，挤压去除多余的乙醇，取其中的两支按取样方法擦拭不锈钢板。
将擦拭后的两支棉签和两支空白棉签分别放入两支干燥洁净的具塞试管中，加塞，加入流动相约5ml，超声洗涤，重复洗涤三次。
5.4检验方法
空白溶液制备：将三次空白棉签洗液合并转入50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，用0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。
对照溶液制备：取缬沙坦对照品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照溶液。
擦拭样品溶液制备：将三次擦拭洗液合并转入50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得擦拭样品溶液。
测定法：分别精密量取空白溶液、对照溶液和供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶液色谱图中杂质峰忽略不计，按外标法以峰面积计算。
5.5 结果计算
测量值计算公式：测量值=50×200×CS×（Au/As）
Cs-对照品溶液浓度，mg/ml
As-对照品溶液峰面积
Au-擦拭样品溶液峰面积
按下式计算回收率：
结果见表，棉签擦拭取样方法检测结果。表明用棉签擦拭取样方法对清洁器具的取样回收率可达79.0%
表棉签擦拭取样法检测结果
重复次数
试管编号
擦拭样品称样量（mg）
测量值（mg）
回收率（%）
1
1
27.09
22.54
83.2
2
2
27.09
21.40
79.0
3
3
27.09
23.48
86.7
回收率报告值
79.0%
回收率RSD
4.6%

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