蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定方法验证

承之

2018/10/31

私聊

紫外可见分光光度计（UV）

1 方法依据
本方法依据GB 5009.188-2003《蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定》。
2 方法原理
用甲醇自试样中提取出甲基托布津，在pH 1~2时，用二氯甲烷提取，甲基托布津经闭环反应转变为多菌灵，提纯后，用紫外分光光度法进行定量测定。多菌灵经提取后可直接测定吸光度而进行定量。
3 试剂
3.1 甲醇
3.2 二氯甲烷
3.3 三氯甲烷
3.4 石油醚：沸程30℃~60℃
3.5 乙酸-乙酸铜溶液：称取2g乙酸铜，加100ml冰乙酸，稍加热溶解，用水稀释至200ml
3.6 盐酸（1+11）：量取盐酸90ml，用水稀释至1000ml
3.7 氢氧化钠溶液（80g/L）：称取8g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml
3.8 氢氧化铵溶液（1+7）：量取氨水10ml，加水稀释至80ml
3.9 氯化钠溶液（100g/L）
3.10 甲基托布津标准溶液：准确称取50.0mg甲基托布津，置于烧杯中，用三氯甲烷溶解并转移至50ml容量瓶中，稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1.0mg甲基托布津。
3.11 甲基托布津标准使用液：吸取10.0ml甲基托布津标准溶液置于100ml容量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，此溶液每毫升相当于100.0ug甲基托布津。
3.12 多菌灵标准溶液：准确称取50.0mg多菌灵置于烧杯中，用盐酸（1+11）溶解移入50ml容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于1.0mg多菌灵。
3.13 多菌灵标准使用液：吸取10.0ml多菌灵标准溶液，置于100ml容量瓶中，加盐酸（1+11）稀释至刻度。此溶液每毫升相当于100.0ug多菌灵。
4仪器
4.1 空气冷凝管
4.2 紫外分光光度计
5分析步骤
5.1 标准曲线的制备
5.1.1甲基托布津标准曲线：吸取0、0.10、0.30、0.50ml甲基托布津标准使用液（相当于0、10、30、50ug甲基托布津），分别置于30ml圆底离心管中，挥干溶剂后，各加10ml乙酸-乙酸铜溶液及2粒玻璃珠，接上空气冷凝管，小火缓缓煮沸0.5h，取下，用20ml盐酸（1+11）从冷凝管顶端洗涤冷凝管和圆底离心管，并移入125ml分液漏斗中，用二氯甲烷提取二次，每次10ml，弃去二氯甲烷层，酸溶液中加25ml氢氧化钠溶液（80g/L）至pH6.0~6.5（pH试纸试），用二氯甲烷提取二次，每次20ml，合并二氯甲烷提取液，用10ml水洗涤一次，静置分层后，将二氯甲烷层分入另一个干的分液漏斗中，准确加入10ml盐酸（1+11），振摇5min，静置分层后，盐酸提取液用1cm石英比色杯，以盐酸（1+11）调节分光光度计零点，测读250nm~300nm的吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收图谱。将图谱上260nm和290nm吸光度读数点连成直线，设直线上282nm的吸光度A，两者之差为ΔA（ΔA=A-A’，为校正吸光度）。再以校正吸光度为纵坐标，甲基托布津的含量为横坐标，绘制各甲基托布津标准点ΔA值的标准曲线。
5.1.2多菌灵标准曲线：吸取0、0.10、0.30、0.50ml多菌灵标准使用液（相当于0、10、30、50ug多菌灵），置于盛有20ml盐酸（1+11）的分液漏斗中，各用二氯甲烷提取二次，每次10ml，弃去二氯甲烷层，水溶液用氢氧化铵（1+7）中和到pH为6.0~6.5（pH试纸试），用二氯甲烷提取二次，每次20ml，提取液用10ml水洗涤一次，以下按甲基托布津自“将二氯甲烷层分入另一个干的分液漏斗中，准确加入10ml盐酸（1+11）”起依法操作，并绘制吸收图谱，计算出ΔA值后，绘制多菌灵的标准曲线。
5.2 试样的提取和分离
称取50.0g切碎、混匀的试样，加50ml甲醇振摇0.5h，用布什漏斗抽滤，容器和滤器用甲醇洗涤二次，每次15ml~20ml，抽干后，滤液移入烧杯中，抽滤瓶用约10ml水洗涤，洗液并入滤液内，在水浴上用空气流吹去部分甲醇后，移入分液漏斗中，加30ml氯化钠溶液（100g/L），用石油醚振摇提取二次，每次25ml，弃去石油醚，加盐酸酸化至pH为1~2（用pH试纸试），用二氯甲烷提取二次，每次25ml，合并二氯甲烷提取液，用25ml水洗涤一次分出二氯甲烷层留作甲基托布津测定用。水洗涤液合并入水层，留作多菌灵测定用。
5.3 甲基托布津的测定
二氯甲烷提取液自然挥干后，用10ml乙酸-乙酸铜溶液分次溶解残渣，并转入30ml圆底离心管中，加2粒玻璃珠，以下按5.1.1自“接上空气冷凝管”起依法操作，计算出试样的ΔA值，再与甲基托布津的标准曲线比较，计算试样中的含量。
5.4 多菌灵的测定
取5.2中留作多菌灵测定的水溶液，再氢氧化铵（1+7）中和至pH6.0~6.5，然后按5.1.2多菌灵标准曲线“用二氯甲烷提取二次”起依法操作，计算出试样中ΔA值，再与多菌灵标准曲线比较，计算试样中的含量。
6结果计算
试样中甲基托布津、多菌灵含量按下式计算：
X=m′×1000/m×1000
式中：
X —试样中甲基托布津、多菌灵含量，单位为毫克每千克（mg/kg）
m′—样品中甲基托布津、多菌灵含量，单位为微克（ug）；
m —试样的质量，单位为克（g）；
计算结果表示到两位有效数字。
7试验结果报告
7.1校准曲线及线性范围：

工作曲线	顺序号	1	2	3	4
	质量（ ug ）	0.00	10.00	30.00	50.00
	吸光值（A）	0.000	0.035	0.093	0.163
回归方程		y = 0.0032x +0.0004
相关系数		0.9984

7.2 方法的精密度
称取约50.0g样品，按照步骤5处理，平行制备9份样品，计算的含量并求出相对标准偏差，结果见下表所示。

顺序号		1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	取样量（g）	50.0176	50.0229	50.0010	50.0098	50.0076	50.0089	50.0006	50.0097	50.0011
	吸光度（A）	0.041	0.041	0.043	0.042	0.041	0.04	0.042	0.041	0.040
	多菌灵含量（ug）	14.06	14.06	14.69	14.38	14.06	13.75	14.38	14.06	13.75
	浓度 mg/kg	0.26	0.26	0.27	0.26	0.26	0.25	0.26	0.26	0.25
平均值	0.26 （S=0.0061）
相对标准偏差 RSD(%)	2.34
备注		结论：九个平行样品的相对标准偏差为2.34%，小于5%，符合要求。

7.3方法的中间精密度
随机选取2名实验人员，按照步骤5测定砷的含量，每个实验者平行测定3份样品，求出两者实验结果的相对标准偏差，结果见下表所示。

表2 中间精密度实验结果

实验者	多菌灵含量(mg/kg)	平均结果(mg/kg)	相对标准偏差(%)
甲	0.26	0.26	2.99
	0.25
	0.26
乙	0.24	0.25
	0.25
	0.25
接受标准: 从精密度测试所得的6组数据中间精密度测试的相对标准偏差应小于5.0%。

7.4方法的准确度
分别向试样中加入一定量的多菌灵，使其砷的加标浓度为10ug/L的样品2ml、分别制备3份样品，按照步骤5处理，同时测定未加标样品硫脲含量，分别计算回收率、结果见下表所示。

样品			标准品			样品加标测量值			回收率（%）	平均回收率（%）
浓度（mg/kg）	取样量（g）	多菌灵含量 (ug) M₁	浓度（ug/ml）	取样量（ml）	M₂ (ug)	吸光度（A）	浓度（mg/kg）	质量 M	回收率（%）	平均回收率（%）
0.252	50.0305	12.6	10	2	20	0.331	0.63	32.81	101.0	102.1
0.248	50.0725	12.4	10	2	20	0.340	0.64	33.13	103.6
0.256	50.0024	12.8	10	2	20	0.322	0.64	33.13	101.6
备注			△%=(M- M₁)*100/ M₂

7.5 检出限
DL=0.02mg/kg
取20次平行测定空白样的结果，按IUPAC规定DL=KSb/50a
其中K=3
Sb:空白多次测得信号的标准偏差：0.0008
a: 校准曲线的斜率:0.0032

顺序号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
吸光度(A)	0.007	0.008	0.007	0.006	0.007	0.006	0.008	0.007	0.008	0.007
顺序号	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
吸光度(A)	0.006	0.007	0.007	0.008	0.006	0.006	0.008	0.007	0.008	0.008
Sb	0.0008
检出限(μg/g )	0.02
公式	DL=fKSb/50a （ K=3, Sb:空白信号的标准偏差，a:曲线斜率）
备注	DL=K*Sb/50a