超高效液相色谱-串联质谱法测定火锅底料中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的回收率问题研究

fcyang

2019/07/01
鹤壁农检联合队

私聊

液相色谱（LC）

超高效液相色谱-串联质谱法测定

火锅底料中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的回收率问题研究

摘要：本研究利用Quenchers法对火锅底料样品进行样品前处理，超高效液相色谱-串联质谱法检测，其中罂粟碱、那可丁、蒂巴因采用外标定量法，吗啡和可待因采用内标法定量。实验结果显示在1.0-50.0ng/mL范围内，罂粟碱、那可丁、蒂巴因线性良好，在5.0-250ng/mL范围内，吗啡和可待因线性良好，以阴性样品基质溶液配制的标准溶液进行定量分析，样品回收率在70%~100%之间。
关键词：Quenchers 线性范围回收率
Abstract: the Quenchers method was used in this study to pre-treat the base material samples of hot pot, and to detect by UPLC-MS/MS. Among them, Papaverine, Noscapine and Thebaine were quantified by external standard method, while Morphine and Codeine were quantified by internal standard method.The experimental results showed that in the range of 1.00-50.0 ng/mL, the linearity of Papaverine, Noscapine and Thebaine was good, and in the range of 5.0-25.0ng/mL, the linearity of Morphine and Codeine was good. Quantified by standard solution of prepared from the negative sample matrix solution , the recovery rate was between 70% to 100%.
Key words: Quenchers linear range recovery
1. 试剂与材料
1.1乙腈：色谱纯
1.2甲酸：质谱纯
1.3 标准品：罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合标准溶液，其中罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为10 mg/L，吗啡、可待因浓度为50 mg/L。
1.4内标物质：吗啡-D3、可待因-D3混合内标溶液20mg/L。
1.5 Quenchers净化包：Agela
1.6 有机滤膜：0.22 μm
2. 仪器设备
液相色谱-串联质谱仪 Agilent 6470：带电喷雾离子源（ESI）；
分析天平：感量0.001g；
离心机：≥10 000 转/分钟；
涡旋混合器。
3. 试验方法
3.1标准溶液的配制：
3.1.1 准确吸取罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合标准溶液1.00mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，得到罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0μg/mL，吗啡、可待因浓度为5μg/mL的标准混合储备液。再分别准确吸取吗啡-D3、可待因-D3混合内标溶液1.00mL，用甲醇稀释并定容至刻度，得到浓度为2.0μg/mL的内标混合储备液。
3.1.2分别精密吸取上述混合标准储备溶液和同位素内标混合储备液（3.1.1）适量，用乙腈（1.1）稀释成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为 1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL，吗啡、可待因浓度为 5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL 的系列标准工作溶液，内标溶液浓度均为 50.0 ng/mL。临用新配
3.2 提取
称取 2 g 火锅底料试样（精确至 0.001 g）于 50 mL 离心管中，加入375 μL 同位素内标溶液（3.1.1），再加入 5 mL 水，振摇使分散均匀，加入 15 mL 乙腈，涡旋振荡 5 min，加入
Quenchers提取管中提取，涡旋震荡1min，以 4000 转/分钟离心 5 min，取上清液待净化。
3.3 净化
移取 1.5 mL 上清液至2ml的Quenchers净化管中，涡旋混合 1 min，以 10 000 转/分钟离心 5 min，移取上清液，0.22 μm 有机滤膜过滤，取滤液待测。
4. 测定
4.1色谱条件
1) 色谱柱：UHP HILIC（粒径1.9μm，2.1×100mm）
2) 进样量：5 μL；
3) 柱温：40 ℃；
4) 流速：0.3 mL/min；
5）流动相：A 相：乙腈，B 相：含 0.1 %甲酸的 10 mmol/L 甲酸铵
溶液，按表 1 进行梯度洗脱

表1梯度洗脱程序

时间/min	A相	B相
0	90	10
0.5	80	20
2.0	80	20
2.5	90	10
4.5	90	10

4.2 质谱条件
1）电离方式：ESI+
2）检测方式：多反应监测（MRM）
3）雾化气、鞘气：氮气
4）干燥气流速：7L/min
5）喷雾电压：500V
6）干燥器温度：300℃
7）鞘气流速：11L/min
8）鞘气温度：300℃
9）毛细管电压：3500V（+）3000V（-）
10）定性离子对、定量离子对、Fregmentor电压及碰撞能量见表2
表2定性离子对、定量离子对、Fregmentor电压及碰撞能量

目标物质	定性离子对（m/z）	定量离子对（m/z）	Fregmentor电压（V）	碰撞能量（eV）
那可丁	414.0/220.0（ESI+）	414.0/220.0（ESI+）	165	21
那可丁	414.0/353.0（ESI+）	414.0/220.0（ESI+）	165	25
罂粟碱	340.4/201.9（ESI+）	340.4/201.9（ESI+）	160	32
罂粟碱	340.4/171.0（ESI+）	340.4/201.9（ESI+）	160	36
蒂巴因	312.3/58.2（ESI+）	312.3/58.2（ESI+）	102	11
蒂巴因	312.3/249.0（ESI+）	312.3/58.2（ESI+）	102	15
可待因	300.4/165.0（ESI+）	300.4/165.0（ESI+）	165	40
可待因	300.4/215.0（ESI+）	300.4/165.0（ESI+）	165	36
吗啡	286.0/164.9（ESI+）	286.0/164.9（ESI+）	160	41
吗啡	286.0/181.0（ESI+）	286.0/164.9（ESI+）	160	41
可待因-D3	303.5/165.0（ESI+）	303.5/165.0（ESI+）	160	40
可待因-D3	303.5/215.0（ESI+）	303.5/165.0（ESI+）	160	36
吗啡-D3	289.1/165.0（ESI+）	289.1/165.0（ESI+）	165	40
吗啡-D3	289.1/185.0（ESI+）	289.1/165.0（ESI+）	165	36

5.线性关系
5.1.1 在4.1、4.2的色谱和质谱条件下上机测定甲醇为溶剂配制的标准溶液并建立标准曲线，得到罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因的线性关系R²分别为0.9968、0.9992、0.9958、0.9987、09993，均满足实验要求。
5.1.2 在4.1、4.2的色谱和质谱条件下上机测定，以净化包处理过的阴性样品基质溶液为溶剂配制的标准溶液并建立标准曲线，得到罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因的线性关系R²分别为0.9971、0.9998、0.9956、0.9991、09989，均满足实验要求。
6.加标回收试验
6.1空白加标试验
分别向6个50mL空白离心管中加入150μL罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0μg/mL，吗啡、可待因浓度为5.0μg/mL的标准混合储备液，后按照3.2、3.3的步骤进行处理后上机，以甲醇为溶剂配制的标准溶液进行定量，得到的平均空白回收率如表3：
表3：甲醇为溶剂配制的标准溶液测定的空白加标回收率

目标物质	添加量（ng/mL）	实测值（ng/mL）	回收率（%）
那可丁	10	3.86	38.6
罂粟碱	10	3.97	39.7
蒂巴因	10	1.96	19.6
可待因	50	49.32	98.6
吗啡	50	48.56	97.1

由表3可得，以甲醇为溶剂配制的标准溶液测定的空白加标回收率中，以内标法定量的吗啡、可待因回收率良好，以外标法定量的罂粟碱、那可丁、蒂巴因回收率太低，达不到标准要求，可见在没有样品基质的条件下净化包中成分对目标物质会有吸附，因此该方法不适合做空白回收试验。
6.2阴性样品加标回收试验1
分别称取 2 g 火锅底料阴性样品（精确至 0.001 g）于6个不同的 50 mL 离心管中，再分别加入150μL罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0μg/mL，吗啡、可待因浓度为5.0μg/mL的标准混合储备液，后按照3.2、3.3的步骤进行处理后上机，以甲醇为溶剂配制的标准溶液进行定量，得到阴性样品平均加标回收率如表4：
表4：甲醇为溶剂配制的标准溶液测定的阴性样品加标回收率

目标物质	添加量（ng/mL）	实测值（ng/mL）	回收率（%）
那可丁	10	4.62	46.2
罂粟碱	10	4.35	43.5
蒂巴因	10	2.63	26.3
可待因	50	48.62	97.2
吗啡	50	49.37	98.7

由表4可得，以甲醇为溶剂配制的标准溶液测定的空白加标回收率中，以内标法定量的吗啡、可待因回收率良好，以外标法定量的罂粟碱、那可丁、蒂巴因回收率太低，达不到标准要求。
6.3阴性样品加标回收试验2
分别称取 2 g 火锅底料阴性样品（精确至 0.001 g）于6个不同的 50 mL 离心管中，再分别加入150μL罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0μg/mL，吗啡、可待因浓度为5.0μg/mL的标准混合储备液，后按照3.2、3.3的步骤进行处理后上机，以净化包处理过的阴性样品基质溶液为溶剂配制的标准溶液进行定量，得到阴性样品加标回收率如表5：
表6：阴性样品基质为溶剂配制的标准溶液测定的阴性样品加标回收率

目标物质	添加量（ng/mL）	实测值（ng/mL）	回收率（%）
那可丁	10	8.54	85.4
罂粟碱	10	8.65	86.5
蒂巴因	10	7.53	75.3
可待因	50	46.92	92.4
吗啡	50	48.33	96.7

由表5可得，以阴性样品基质为溶剂配制的标准溶液测定的阴性样品加标回收率中，吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁、蒂巴因回收率均符合标准要求，且以内标定量的回收率优于以外标定量的回收率。
7.结论
Quenchers法进行样品前处理，超高效液相色谱-串联质谱法检测火锅底料中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的实验结果显示在1.0-50.0ng/mL范围内，罂粟碱、那可丁、蒂巴因线性良好，在5.0-250ng/mL范围内，吗啡和可待因线性良好。在没有样品基质的条件下，Quenchers试剂包中的成分对目标物质会有吸附严重降低空白的回收率，因此该方法不适合做空白回收率试验。同时样品基质会严重降低样品加标回收率，当用阴性样品基质溶液配制的标准溶液定量分析时，样品加标回收率才能满足实验要求，且以内标法定量的样品回收率优于外标法。