GB 5009.32-2016测定抗氧化剂的方法优化

关键词：食用油；抗氧化剂；GB 5009.32-2016；回收率

1 固相萃取小柱的选择和分布收集

在国标GB 5009.32-2016中，采用的是C18固相萃取柱，在SPE操作过程中，分布收集是一种非常实用的实验技巧，分布收集就是通过收集上样液、淋洗液、洗脱液甚至进行二次洗脱，并上机分析，从而判断目标化合物具体损失的环节，明确实验步骤中具体需要优化的环节。

根据以上讲述，确定实验方案，进行实验，得出了实验数据。

基质：植物油

准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加标（1000ppm，100ul），加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待上样。（实验过程记得避光操作）

净化

小柱： C18 SPE 小柱500mg/6mL

活化：5ml甲醇

平衡：5ml乙腈

上样：全部待净化液 ，收集

洗脱：5ml乙腈：甲醇（2:1），收集

二次洗脱：10ml乙腈：甲醇（2:1），收集。

氮吹浓缩：全部上样液和洗脱液一起收集浓缩，在40℃下旋蒸至1ml左右，转移至15mL离心管中，用少量乙腈润洗旋蒸瓶3次，合并后40℃氮吹至0.5mL，用乙腈定至2mL，涡旋30s，过0.22um PVDF或PTFE滤头后，用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器测定。

平行样：每个做一个基质空白，两个基质加标，其实验结果如下：

通过以上实验数据，我们可以看到上样液中检测到大部分的目标物，C18小柱对9种抗氧化剂的保留率都非常低，二次洗脱中有少量的目标物，而且比较上样、洗脱和二次洗脱回收率之和可以发现，HC-18对TBHQ和BHT的回收率均较低。

然而GB 5009.32-2016却明确写道：

这里再次说明下固相萃取小柱有两种工作模式：一种是除杂模式：如C18小柱，农药残留用的小柱等，还有一种是洗脱模式：如着色剂小柱，瘦肉精用的MCX小柱等；GB 5009.32-2016将c18小柱的工作模式误认为是洗脱模式了，所以才会出现将上样液给予弃去的情形。

因此，接下来的实验就需要增加洗脱液体积，上样液和洗脱液一起接收，并且想办法提高TBHQ和BHT的回收率。

2 添加保护剂

为什么TBHQ和BHT的回收率依然低，通过查阅资料和文献，终于在一份行业标准中发现了秘密，在行业标准SNT3849-2014《出口食品中多种抗氧化剂的测定》中，在进行抗氧化剂的提取时，它在提取溶剂正己烷饱和的乙腈中添加了L-抗坏血酸棕榈酸酯（AP），L-抗坏血酸棕榈酸酯( AP) 对金属离子有螯合作用能够促进氧化的微量金属离子钝化，从而降低抗氧化剂在提取和浓缩过程中被氧化的程度， 减缓抗氧化剂的氧化速率，提高回收率。另外，在试验确定的检测条件下 AP 不会对其他抗氧化剂造成干扰。

又进行了一次实验，添加AP和不添加AP 进行比较，实验方案和实验数据如下。

基质 植物油

含AP的正己烷饱和的乙腈溶液：1L正己烷饱和的乙腈中溶解0.1gL-抗坏血酸棕榈酸酯（AP)

前处理1：准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加标（1000ppm,100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待上样。（实验过程记得避光操作）

前处理2：准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加标（1000ppm,100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用5mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用5mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液溶液提取2次，合并3次提取液，待上样。（实验过程记得避光操作）

净化

小柱：C18 SPE 小柱500mg/6mL

活化：5ml甲醇

平衡：5ml乙腈

上样：全部待净化液 ，收集

洗脱：15ml乙腈：甲醇（2:1），收集

氮吹浓缩：全部上样液和洗脱液一起收集浓缩，40度氮吹至干，加2ml乙腈定容，过0.22μm PTFE滤膜，上机分析。

平行样：每种前处理方法做一个基质空白，两个基质加标

可以发现，添加AP后，TBHQ回收率已达到90以上，而BHT虽然有提高，但是回收率依然达不到要求，因此还需要进行再次优化。

3 增加提取次数

BHT的回收率依然不好，又进行了一系列实验，比如氮吹不吹干等，发现回收率依然没有提高，在这种情况下，又测了一下提取液的回收率，果然，BHT的回收率只有60，这可能是由于BHT易溶于油脂中，在液液萃取过程中不容易提取出来。因此，遵循“少量多次”的提取原则，将国标GB 5009.32-2016中的提取次数由3次增加到了5次，发现BHT的回收率终于达到了80以上，最终确定的实验方案和实验数据如下。

基质 植物油

含AP的正己烷饱和的乙腈溶液：1L正己烷饱和的乙腈中溶解0.1gL-抗坏血酸棕榈酸酯（AP)

准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加入3mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用3mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用3mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液提取4次，合并5次提取液，待上样。

净化

小柱：C18 SPE 小柱500mg/6mL

活化：5ml甲醇

平衡：5ml乙腈

上样：全部待净化液 ，收集

洗脱：15ml乙腈：甲醇（2:1），收集

全部上样液和洗脱液一起收集浓缩，在40℃下旋蒸至1ml左右，转移至15mL离心管中，用少量乙腈润洗旋蒸瓶3次，合并后40℃氮吹至0.5mL，用乙腈定至2mL，涡旋30s，过0.22um PVDF或PTFE滤头后，用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器测定。

平行样：一个基质空白，两个基质加标

仪器测定条件

仪器：HPLC-DAD

色谱柱：C18（4.6*100mm*2.6um）

流动相梯度：

流速：1.0mL/min；

柱温：35 ℃

进样量：10μL

检测器波长：280nm

实验谱图

1：50ppm标准谱图

2：植物油基质空白谱图

3：植物油基质加标50ppm

最后，再总结一下，进行SPE操作回收率不好时，该怎么优化。最重要一步的就是分布收集，发现目标物损失的步骤，进行改善，如果回收率依然不好，就需要考虑提取的步骤，目标物的性质（是不是易降解）等，大家都学会了吗？依GB 5009.32-2016测定食用油中的抗氧化剂前处理优化后的结果：用含AP的正己烷饱和的乙腈溶液提取，并重复提取4次，合并5次提取液；净化时：过C18小柱时要将全部上样液和洗脱液一起收集浓缩，并注意整个实验过程要避光进行（用棕色的离心管，棕色的旋蒸瓶，棕色的液相进样小瓶），这样各种抗氧化剂的回收率可达到90%以上。