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BioCore 系列色谱柱在多肽聚合物检测中的应用

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    2023/02/08
  • 私聊

液相色谱(LC)

  • BioCore 系列色谱柱在多肽聚合物检测中的应用





    随着生物技术的不断发展,由于多肽药物适应证广,安全性高、用量少且疗效显著,多肽药物 目前在临床上的应用越来越广泛,相应的质量研究也越来越深入。多肽药物是由多个氨基酸通过肽 键链接而形成的一类化合物, 由于分子量大,结构相对复杂,活性位点多,结构稳定性相对较差, 随着产品的放置,容易产生降解,形成聚合物,由于极性相近,反向色谱法很难将其有效分离,定 量检测。结合聚合物分子量大小不同的特点,采用分子排阻法进行聚合物的分离,参照《中国药典》2020 年版四部及其相关资料,建立了十二肽化合物中聚合物的检测方法,通过该方法控制聚合物

    杂质的量来保证产品质量。



    1 实验材料

    1.1 仪器信息

    Waters 2695-2487 型高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司);MSA225S-1CE-DU 型电子分析天平

    (德国赛多利斯公司);NBL-214i 电子天平(艾德姆衡器武汉有限公司)

    1.2 试剂与试药信息

    十二肽对照品(批号:D20201101,纯度:86.7%);Dimer 聚合物对照品(批号:D20200529,纯度:81.8%);磷酸二氢钠(色谱纯)批号:20200316,厂家:天津市科密欧化学试剂有限公司; 无水硫酸钠(色谱纯)批号:20200110,厂家:天津市科密欧化学试剂有限公司;十二水合磷酸氢二钠(色谱纯)批号:20200143,厂家:天津市科密欧化学试剂有限公司。

    2 试验方法和结果

    2.1 色谱条件

    色谱柱:BioCore SEC-150 5μm7.8×300mm 纳谱分析技术(苏州)有限公司;

    流动相:含磷酸二氢钠 0.05 mol/L、磷酸氢二钠 0.05 mol/L、硫酸钠 0.1 mol/L 的混合溶液; 洗脱方式:等度洗脱;

    流速:0.5 mL/min 检测波长:274 nm 柱温:30 ℃;

    进样量:10 μl

    2.2 溶液制备

    2.2.1 系统适用性溶液的配制

    取十二肽对照品、Dimer 聚合物对照品适量,加流动相溶解,制成每 1 mL 中含十二肽约 2.0 mg

    Dimer 聚合物约为 0.2 mg 的混合溶液,作为系统适用性溶液。

    2.2.2 供试品溶液的配制

    取本品适量,加流动相溶解并稀释制成每 1 mL约含 2 mg 的溶液,作为供试品溶液。

    2.2.3 对照溶液的配制

    精密量取供试品溶液 1 mL,用流动相定容至 100 mL,混匀,作为对照溶液。

    2.3. 方法学验证

    2.3.1 仪器精密度

    2.2.1”项下系统适用性溶液,采用“2.1”项下的色谱条件,连续进样 6 次,考察各峰保留时间和峰面积的 RSD。系统适用性中各峰保留时间的 RSD≤1.0%,峰面积的 RSD≤2.0%,表明该方法仪器精密度良好。仪器精密度结果见表 1,图谱见图 1

    1 仪器精密度检测结果


    名称


    主成分


    Dimer 聚合物




    仪器精密度


    保留时间

    min


    峰面积

    mAu*min


    保留时间

    min


    峰面积

    mAu*min


    系统适用性溶液 1


    23.838


    2715042


    22.058


    228285


    系统适用性溶液 2


    23.837


    2714873


    22.063


    226972


    系统适用性溶液 3


    23.835


    2709066


    22.065


    226038


    系统适用性溶液 4


    23.836


    2707598


    22.071


    226798


    系统适用性溶液 5


    23.838


    2709442


    22.079


    225603


    系统适用性溶液 6


    23.841


    2703447


    22.086


    224641


    RSD%


    0.1


    0.2


    0.1


    0.6

    1 仪器精密度重复进样 6



    2.3.2 专属性

    2.3.2.1 专属性溶液的配制空白溶剂:流动相。

    十二肽对照品溶液:称取对照品适量,加流动相溶解并稀释至2 mg/mL的溶液。

    Dimer 聚合物溶液:称取 Dimer 聚合物对照品适量,加流动相溶解并定容至 10 mL,再取 1 mL 加流动相定容至 5 mL,混匀。

    系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液配制同2.2 溶液制备”项下。

    2.3.2.2 结果分析

    空白溶剂对主峰及 Dimer 聚合物检出均无干扰,主峰与 Dimer 聚合物分离度大于 2.0,理论塔板数

    按十二肽主峰计算大于 30000,各峰纯度均大于 980,专属性良好。代表性图谱详见图 2~ 4

    2 空白溶剂

    3 Dimer 聚合物杂质定位


    4 系统适用性试验


    2.3.3 检测限与定量限

    Dimer 聚合物检测限为 19 ng,定量限为 40 ng6 个定量限重复性溶液中保留时间的 RSD

    0.09%,小于 1.0%6 个峰面积的 RSD 5.73,小于 8.0%,均符合要求。结果详见表 2

    2 定量限与检测线检测结果






    信噪比(S/N


    10


    定量限


    40 ng


    3


    检测限


    19 ng


    定量限重复性


    名称


    1


    2


    3


    4


    5


    6


    RSD%


    保留时间(min


    22.613


    22.601


    22.598


    22.577


    22.571


    22.558


    0.09


    峰面积(mAu*min


    2571


    2238


    2358


    2325


    2191


    2405


    5.73


    2.3.4 线性与范围

    在定量限~限度值的 150%范围内,配制 6 份不同浓度溶液,进行线性测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归分析。

    配制十二肽和 Dimer 聚合物线性溶液(线性溶液 1(定量限)、线性溶液 250%)、线性溶液 3

    80%、线性溶液 4100%、线性溶液 5120%、线性溶液 6150%))试验,十二肽及Dimer 聚合物的线性相关系数 r≥0.990,截距均在 100%响应值的 25%以内,说明此范围内十二肽和Dimer 聚合物的线性关系良好。验证结果见表 3

    3 线性与范围检测结果



    十二肽


    线性系列

    线性-1



    线性-2


    线性-3

    线性-4



    线性-5

    线性-6



    X(浓度 μg/ml)

    1.540



    5.133


    8.213

    10.27



    12.32

    15.40



    Y(峰面积μV*s

    3309



    7785

    12058



    15112


    18371


    23189


    曲线


    y=1438.69x+625.70


    R


    0.999


    100%响应值的 25%


    3753.15


    截距


    625.70


    Dimer 聚合物


    线性系列

    线性-1



    线性-2

    线性-3



    线性-4


    线性-5


    线性-6


    X(浓度 μg/ml)

    4.005



    5.006

    8.010



    10.01


    12.01


    15.02


    Y(峰面积μV*s

    3243



    4296

    7403



    8860


    10308


    13690


    曲线


    y=920.71x–329.90


    R


    0.998


    截距


    329.90


    100%响应值的 25%


    2219.29


    2.3.5 重复性

    2.2.2 2.2.3”项下方法平行配制 6 份供试品溶液和对照溶液,均采用自身对照法进行计算结果。6 个供试品中Dimer 聚合物含量的RSD≤6.0%,说明该方法重复性良好。

    2.3.6 溶液稳定性

    2.2.2 2.2.3”项下方法平行配制 6 份供试品溶液和对照溶液,置于室温环境中,每隔 2 小时取样检测,考察 24 小时。结果显示两种放置条件下,对照溶液峰面积 RSD%≤6.0%Dimer 聚合物含量的 RSD%≤6%,说明本品的供试品溶液和对照溶液在室温条件下放置 24h 稳定性良好。验证结果见表 4

    4 溶液稳定性考察结果



    时间(h


    对照溶液峰面积


    Dimer 聚合物(%


    0


    18117


    0.42


    2


    18049


    0.40


    4


    17725


    0.39


    6


    18414


    0.40


    8


    18188


    0.39


    10


    17991


    0.40


    12


    17488


    0.41


    14


    17243


    0.40


    16


    17335


    0.40


    18


    17118


    0.42


    20


    17266


    0.39


    22


    17453


    0.39


    24


    17531


    0.39


    RSD


    2.4%


    3.0%

    2.3.7 耐用性

    2.2.2 2.2.3”项下方法配制供试品溶液和对照溶液,采用自身对照法进行计算结果。通过改变波长(274±2 nm)、流速(0.5±0.1 mL/min)、柱温(30±2 ℃),各条件下测得Dimer 聚合物含量的RSDn=7)小于6%,说明本方法耐用性良好。验证结果见表5

    5 耐用性检测结果




    条件




    标准条件


    流速

    0.4 mL/min


    流速

    0.6 mL/min


    波长

    272 nm


    波长

    276 nm


    柱温

    28


    柱温

    32




    RSD





    Dimer 聚合物




    0.40%




    0.41%




    0.40%




    0.41%




    0.39%




    0.40%




    0.39%




    2%


    3.讨论

    综合分析及评价:对十二肽聚合物检测方法进行了仪器精密度、专属性、检测限与定量限、线性与范围、重复性、溶液稳定性、耐用性的验证,各项验证结果均符合设定要求,该方法适用于十二肽聚合物的检测。

    综上,采用BioCore SEC-1505μm 7.8×300mm)色谱柱能够有效的分离本品中的聚合物杂质,该色谱柱耐用性良好,分离效果较优,能够准确检测聚合物杂质含量,较好的控制产品质量。


    公司名称:哈尔滨吉象隆生物技术有限公

    色谱柱信息:纳谱分析 B io Core SEC-150 5μm, 7.8×300mm),SN395042-000169
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