天然多糖研究体积排阻色谱柱选择初探
多糖是最丰富的生物聚合物，已被发现参与许多生物过程，例如细胞间通讯、胚胎发育、细菌和/或病毒感染以及体液和细胞免疫。因此，多糖与核苷酸、蛋白质、脂质一起构成了生命科学中最重要的四大生物大分子。
尽管多糖已在各种工业应用中使用了几十年，例如 药物、生物材料、食品和营养以及生物燃料，对多糖在生命科学中的重要性的日益了解和深入研究正在推动多糖用于新型（生物分子）应用的开发。不断有来自植物（膳食纤维、草药和木本植物）、藻类和地衣的生物活性多糖，以及来自动物的其他生物活性多糖（例如肝素、硫酸软骨素和透明质酸）被报道。
天然多糖发现的主要方法为提取纯化得到相对较纯的多糖组分，从而进行结构表征和活性评价。具体而言，通过水提醇沉得到粗多糖，再通过弱阴离子交换色谱法（DEAE）进行纯化，得到不同盐梯度洗脱的组分。对于这些组分，需要通过体积排阻色谱法（SEC）分析判定，是否需要进一步纯化；得到纯品之后，需要测定多糖组分的分子量；研究多糖在体内的降解规律，也需要SEC判定多糖分子量的变化。因此，多糖研究实验室往往需要多支SEC色谱柱，以适应不同的用途。研究人员热切期望有一只首选SEC色谱柱，可以快速开展研究。本文以小秦艽多糖的研究为例，说明BioCore SEC-1000作为多糖研究的首选色谱柱，在多个用途中的效果。
小秦艽，学名为达乌里秦艽(Gentiana dahurica Fisch)，为龙胆科植物龙胆属多年生草本植物，始载于《神农本草经》，列为中品，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效。小秦艽多糖经过提取和除杂后，通过中压制备液相（DEAE填料）填料纯化，得到四个组份。在后续多糖组份纯度判定和降解规律研究中，使用了BioCore SEC-1000色谱柱。
一、实验条件与方法
1.1. 仪器及色谱条件
高效液相色谱仪：安捷伦 1260 infinity II，配有Wyatt，Optilab T-REX示差折光检测器（RI）; 岛津LC-2030C，配有岛津RID-20A1.2示差折光检测器（RI）；大连依利特有限公司 Elite 1100 液相色谱仪，配有岛津RF-20AXS荧光检测器（FLD）。
色谱柱：T (13μm，7.8×300mm)或Biocore SEC-1000（5μm, 7.8×300mm）；
流动相：50 mM NH4OAc (80%)+Methanol (20%)；
流速：0.5 mL/min；
柱温：25℃；
进样量：20 μL；
采集时间：30 min。
1.2 样品处理
1）秦艽多糖组份纯度分析：称取秦艽多糖GDP-3（即样品0.3 M）约5 mg，溶于流动相，配制成10 mg/mL溶液。上样前用0.22 μm滤膜过滤。
2）多糖GDP-2体外稳定性的考察： GDP-2的经 FITC荧光标记（产物为FGDP-2），进行体外模拟消化。模拟胃液由胃蛋白酶(10 g/L)和稀HCl (16.4 mL/L)组成，调节pH至1.3。将FGDP-2 (25 mg/mL)与各人工胃液和人工肠液10 mL混合，37℃孵育。分别于0 h、4 h、6 h、12 h取孵育液各500 μL作为HPLC-FLD测定样品。用0.2 M NaOH和TCA (20 % , w/w)终止反应。
二、结果与讨论
多糖纯度及分子量的测定是多糖结构解析及构效关系研究的关键步骤。小秦艽多糖的纯化色谱洗脱曲线如图1所示，一共得到四个组份。
图1 小秦艽多糖的DEAE纯化色谱图（硫酸苯酚法重构）
组份经透析、冻干后，首先需要确定它的纯度。如果组份不纯，则后续的核磁分析将是徒劳无功的。我们实验室前期配备了三支不同孔径的SEC色谱柱，经分析组份1和2较纯，而3和4不纯。如果不纯，则需要通过凝剂渗透色谱（GPC）进一步纯化。SEC分析可以确定组份的数目，以在GPC纯化时收集馏分。
在用实验室已有SEC色谱柱分析时（图2上），色谱峰数目不明确。该色谱柱孔径为450?，粒径为13 μm，分离度不理想，可能分子量超出其适用范围。于是改用孔径更大且粒径为5 μm的Biocore SEC-1000柱进行试验（图2下），结果表明分离效果好，明显识别为三个色谱峰。为该组份的后续纯化以及多糖稳定性的考察提供基础。
图2 秦艽多糖分子量的分析色谱图
（上图，实验室已有色谱柱T；下图，纳谱Biocore SEC-1000）
此外，该色谱柱，分离中等分子量多糖标准品（36 kDa ~ 131 kDa）时，也呈现了较好的线性关系。因此，我们认为该色谱柱具有分子量适用范围宽的优点，可以作为多糖分析中的通用SEC色谱柱。
为了确定秦艽多糖的体外消化模式，选取了经测量相对较纯的秦艽多糖GDP-2组分进行荧光标记，建立了HPLC - FLD分析方法，进行体外稳定性考察。通过上述实验对SEC柱的比较分析，选取了分离效果较好的Biocore SEC-1000进行该实验。FGDP-2在模拟胃液中的分子量随时间变化色谱图如图3所示，发现色谱峰的相对峰高向小分子偏移，说明FGDP-2在消化4 h后发生部分降解。可能是由于多糖对酶和强酸敏感，导致多糖的糖苷键断裂。然而，观察到整个消化系统中没有单糖出现，胃和肠道不会造成多糖结构的过度损失。
图3模拟胃液消化过程中FGDP-2的HPLC - FLD表征
三、小结
多糖研究人员往往面对不同来源的多糖分子，分子量差异较大，从几万到上百万的多糖分子量。在多糖的研究过程中，需要一支通用的SEC色谱柱，进行快速分子量判断，以确定后续研究操作。BioCore SEC-1000在我们对小秦艽多糖的分子量纯度分析、分子量测定和体外消化稳定性等研究中，均获得了良好的效果。我们认为，BioCore SEC-1000可以作为多糖研究实验室的首选SEC色谱柱。
公司：苏州大学药学院
色谱柱信息：BioCore SEC-1000 5μm, 7.8×300mm
应助达人
仪器信息网“仪友会”招募令
科学仪器品牌联合“仪器心得”征文活动
【生活中的仪器检测】有奖征文
LC-MS实验瓶颈的突破与优化
