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【“仪”起享奥运】聚合酶链式反应法鉴别之金钱白花蛇
小卡
2024/08/08
私聊
中药/天然药检测
鉴别
|
聚合酶链式反应法。
模板DNA提取
取本品0.5g,置乳钵中,加液氮适量,充分研磨使成粉末,取50mg,置2.0ml离心管中,加入提取缓冲液200μl(含1%聚乙烯吡咯烷酮-40和1%曲拉通 X-100的0.5mol/L氢氧化钠溶液),充分混匀;加入0.1mol/L Tris-盐酸溶液(pH 8.0)800μl,混匀,离心(转速为每分钟12000转)5分钟;将上清液500μl转移至另一离心管中,加入0.1mol/L Tris-盐酸溶液(pH 8.0)500μl,混匀,离心(转速为每分钟12000转)5分钟;将上清液50μl转移至另一离心管中,加入无菌双蒸水450μ1,混匀,作为供试品溶液,置一20℃保存备用。另取金钱白花蛇对照药材0.5g,同法制成对照药材模板DNA溶液。
PCR
反应
鉴别引物:
5
’
GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3
’和
5
’
GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA3
’。
PCR
反应体系:在200μl离心管中进行,反应总体积为25μl,反应体系包括10×
PCR
缓冲液2.5μl,
dNTP
(1Ommol/L)1μl,鉴别引物(10μmol/L)各0.2μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl,模板DNA 1μl,25%聚乙烯吡咯烷酮-40溶液1μl,10mg/ml牛血清蛋白0.5μl,无菌双蒸水18.4μ1。将离心管置
PCR
仪,
PCR
反应参数:95℃
预变性
5分钟,循环反应30次(95℃30秒,60℃45秒),延伸(72℃)5分钟。
电泳检测
照琼脂糖凝胶电泳法(通则0541),胶浓度为1.5%,每100ml胶中加入10000×核酸凝胶染色剂GelRed 5μl;供试品与对照药材
PCR
反应溶液的上样最分别为5μl,以DL2000(DNA条带从小到大分别为100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp和2000bp)作为DNA分子量标记,进行凝胶电泳检测。电泳结束后,取凝胶片在
凝胶成像仪
上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中,在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上,在500~750bp之间应有单一DNA条带,空白对照无条带。
浸出物
|
照醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,用稀乙醇作溶剂,不得少于15.0%。
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私聊
Ins_6f9028ca
第1楼
2024/08/08
感谢分享!
0
发表回复
+关注
私聊
xiahuanihao
第2楼
2024/08/13
了解中药材金钱白花蛇。
0
发表回复
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