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【“仪”起享奥运】理化检测校准曲线！一文教你学会

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2024/08/09

食品常规理化分析

一、校准曲线及参数的定义

1.校准曲线的定义

校准曲线：是指描述待测物质浓度或量与相应的测量仪器响应量或其它指示量之间的定量关系的曲线。

校准曲线包括标准曲线和工作曲线。

标准曲线：取不同含量标准溶液，直接加入试剂，显色后进行测定，得出浓度值与信号值的线性关系。

工作曲线：取不同量标准溶液，经过与样品分析相同的前处理步骤(如蒸馏、消解、水浴、萃取、振荡等)，由此得出浓度值与信号值之间的线性关系。

注意：如经过试验证实，标准溶液系列在省略部分操作步骤时，直接测量的响应值与全部操作步骤具有一致结果时，可允许省略步骤。

2.校准曲线相关参数的定义

空白试验：在制作校准曲线时必须同时作两个空白试验。空白试验是除用水代替样品外，其他所加试剂和操作步骤均与样品测定完全相同的操作过程。

试验用水、试剂质量、器皿、实验室环境及操作过程中的沾污等因素都影响空白试验的测定值(即空白值)。如空白值出现异常，会影响测定结果的准确度，应从上述几方面寻找原因。

这些影响因素控制好后，每个分析项目的空白值均会在一定范围内波动。一般来说，空白值越小越好。

相关系数(r)：表示校准曲线的精密度，分光光度法要求 r ≥0.999，否则应查找原因加以纠正，重新制作合格的校准曲线。

截距(a)：表示校准曲线的准确度。影响因素包括容量器具，光度测量仪器的误差(比色皿的成套性，非单色光引起的偏差，仪器的线性等)、操作误差等，也有方法本身的因素。校准曲线截距的最后一位数，应与因变量的最后一位数取齐。

斜率(b)：表示校准曲线的灵敏度。它除了受方法的灵敏度影响外，还与显色反应条件(如环境温度、显色温度、试验用水、试剂质量、显色溶液的pH值)、标准溶液的准确度、测量仪器的灵敏度、波长的准确度以及分析人员的操作水平等有较大关系。

上述这些影响因素控制好，大多数分析项目的斜率能保持在一定的范围内，当发现斜率上移或下降，超出了范围，应从各影响因素中查找。

线性范围：是某分析方法校准曲线的直线部分所对应的待测物质浓度或量的变化范围。

二、如何检验标准曲线？

1.校准曲线的线性检验

校准曲线的线性检验，即精密度检验。根据数理统计知识，若2个变量呈线性关系，则关系的密切程度可用简单线性相关系数r来表示。在Excel中的函数是PEARSON（皮尔生）函数。r值的范围在-1~1。r>0为正相关，r<0为负相关。r的绝对值越大，则相关程度越高；r值越接近于0，相关越不密切；当r=0时，表示2个变量之间不相关。

在水质检验中，明确要求|r| ≥0.999；对于石墨炉原子吸收光谱法，|r| ≥0.995也能接受。

某些分析项目，由于含量很低或操作中的影响因素较多，如原子吸收中的石墨炉分析，某些气相色谱项目，相关系数可适当放宽，要求|r| ≥0.995。

如果校准曲线的相关系数不能满足规定的要求，则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。通常情况下，影响校准曲线相关系数的因素主要包括：标样系列的配制、测定波长、光源状态、进样方式及分析方法本身的精密度、仪器的精密度等。

2、校准曲线的截距检验

校准曲线的截距检验，即准确度检验。截距表示试剂空白的大小，它是围绕总体均值0呈正态分布的随机变量，是实验室误差在y轴上的反映。实验误差越小，截距越趋近于0。理想的回归直线，截距a=0。

一般要求a≤0.005，当a>0.005时，应作截距的显著性检验。但由于存在难以控制的随机因素，实验中存在正的或负的系统误差，多数回归直线的截距不为0。遇到这种情况时，需要按统计程序将所得截距a与0作t检验，即显著性检验。

经检验，在给定置信水平下（通常取95%）无显著性差异时，a方可作0处理；若a与0存在显著性差异，表示校准曲线的回归计算结果准确度不高，应找出原因予以校正。回归方程如果不经上述检验和处理就直接投入使用，则必将给测定结果引入差值等于a的系统误差。

截距检验也可以采用截距a对相对剩余标准偏差 SE 的相对值作为检验指标。根据经验值，其容许范围为≥30%。对于不同的分析方法和精密度要求，容许范围可作适当的调整。

3. 斜率检验

即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的，在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。

例如：一般来说，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于5%，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等。

4. 剩余标准偏差或相对偏差的检验

由于校准曲线的斜率常随环境温度、试剂批号和贮存时间等实验条件的改变而变动，因此，在测定试样的同时绘制校准曲线是最为理想的。

但在实际检测工作中，当一定期限内的环境、气候、仪器、人员等条件变化不大时，可以使用相同的校准曲线，而不需要每次都绘制。

此时，需要根据设备或方法的稳定性定期对校准曲线进行检查，使用的统计量就是剩余标准偏差SE或相对偏差。

剩余标准偏差SE是通过线性回归法，计算纵坐标预测值所产生的标准误差。在Excel中的函数是STEYX函数。校准曲线用y=a+bx来表示。

根据正态分布原理，线性方程在不同置信水平下的置信区间为式(1)—式(3):

68.3%置信区间y=a+bx±S_E (1)

95.5%置信区间y=a+bx±2S_E (2)

99.7%置信区间y=a+bx±3S_E (3)

当检查校准曲线时，需要测定空白平行样和曲线中间点浓度平行样，并分别求取信号值的平均值，再以中间点浓度的信号值扣除空白。当所获信号值没有落在相应置信区间时，则曲线不能再被使用，需要重新测定标样系列，并重新制作回归曲线。

三、斜率运用及稳定性判断

对于校准曲线斜率稳定的分析项目，误差较小，在样品分析中可以使用原校准曲线，但应在样品分析同时，带两个空白试验和一个中间标准点。中间标准点测定值与标准曲线相应点浓度的相对误差不超过10%，否则应重新制作校准曲线。尽管如此，校准曲线也应两个月制作一次。

在比色分析中，当仪器条件发生变化(如调换光源灯泡，仪器波长校正，或仪器经过维修等因素)、标准溶液新配制时，标准曲线也应重新制作。

以环境监测项目为例，如分析中空白试验的吸光度出现了异常，校准曲线的斜率达不到要求，都要逐一寻找原因，直到符合要求为止。

校准曲线的影响因素错综复杂，例如实验用水不仅能引起空白值的偏高，也可能引起截距和斜率的变化。而且每个分析项目的影响因素又不完全相同，因此要求每个分析人员能熟练运用，具体问题具体分析。

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