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【金秋计划】琼脂糖凝胶电泳技术详细操作步骤和详解
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2024/09/06
私聊
食品常规理化分析
一、琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳是一种重要的分子生物学研究方法,?它利用琼脂糖凝胶的网络结构,?通过电场作用使带电颗粒(?如DNA或RNA)?在凝胶中移动,?根据分子大小和电荷性质的不同实现分离。?这种技术不仅操作简单迅速,?而且具有高分辨率,?因此在基因操作中扮演着关键角色,
其
原理主要基于DNA分子的两大特性:电荷效应和分子筛效应。
?琼脂糖是一种天然的长链状聚合分子,它在沸水中溶解,当温度降至45℃时开始凝固并形成多孔刚性立体网状结构,其孔径的大小取决于琼脂糖的浓度。
分子筛效应
指的是琼脂糖凝胶由琼脂糖分子交联形成的网状结构,其孔径大小与琼脂糖浓度成反比。当DNA分子通过凝胶时,会受到凝胶孔径的阻碍。较小的DNA片段可以通过凝胶孔隙,而较大的DNA片段则会被阻挡,导致迁移速率降低。??
电荷效应
指的是DNA分子在碱性条件下(pH>7)会电离,带负电荷。当DNA样品置于电场中时,在外加电场的作用下受到电场力的作用,向正极方向移动。DNA分子的迁移速率与其所带的电荷量成正比,而电荷量又与DNA片段的长度成正比。因此,在相同电场条件下,较长的DNA片段迁移速率较慢,而较短的DNA片段迁移速率较快。不同DNA的分子量大小及构型各不相同,因此它们在电泳中的迁移率也会有所不同,从而可分离出不同的区带。
为什么核酸条带显示荧光?
主要便于观察,对核酸进行了染色。溴化乙锭EB是一种扁平状分子,在紫外光照射下能发射荧光。当EB与DNA分子形成EB-DNA复合物后,其发射的荧光强度比游离状态的EB提高10倍以上,且荧光强度与DNA的含量呈正比。
二、?琼脂糖凝胶电泳的详细操作步骤(1%琼脂糖凝胶电泳为例)
1.安装制胶模具
:
利用电泳托盘,安装制胶模具,水平放置于试验桌上。
2.
制备琼脂糖凝胶:
将琼脂糖粉末溶解于缓冲液中,加热煮沸,冷却后凝固成凝胶。(根据电泳所需要的分辨率准备琼脂糖-电泳缓冲液凝胶溶液)
(1)
称取
1g
琼脂糖,放入盛有
100mL 0.5×TBE
缓冲液的
500mL
三角瓶中,摇匀用天平称量其重量,摇匀。在微波炉中,使琼脂糖完全溶解,放回天平上,加入蒸馏水补齐至初始重量。冷却至不烫手(
55℃
左右),加入
100μL
0.5mg/mL EB
溶液(终浓度为
0.5 μg/mL
),或加入
5-10μL
StarGreen DNA Dye(GenStar)
,摇匀。
(2)
将凝胶溶液倒入安装好的制胶模具中,凝胶厚度应在
3-5mm
。
(3)
选择合适的梳子,梳子的插入深度应使齿的底部和板的表面距离在
0.5
到
1.0mm
。要检查梳子齿下方或之间是否有气泡,在室温下冷却凝固。
(4)
待凝胶充分凝固后,垂直向上小心拔出梳子,以保证点样孔完好。
(5)
将凝胶置入电泳槽中,加入
0.5×TBE
缓冲液
,以浸没凝胶约1mm为合适。
3
.
制备DNA样品:
将DNA样品与上样缓冲液混合。
把DNA样品和上样缓冲液混合,利用
移液枪
把电泳样品加到没入缓冲液中凝胶槽中,在凝胶的两侧样品槽内加入合适的分子量标准品。
上样量的多少根据样品中DNA片断的多少和大小而定,已知浓度的DNA用于估测样品质粒DNA的浓度。
4.
电泳:
将DNA样品加载到凝胶上的样品孔中,在电场的作用下进行电泳。
盖上电泳槽的盖子,正确连结电泳槽上的导线。电泳电压以正负电极的距离的一到五倍为合适(1到5V/cm)。如果电泳线连接正确,那么在进行电泳时可以看到有气泡从电泳槽内电极导线处产生,同时,在几分钟后,可见溴酚蓝条带从负极向正极移动,从上样槽内移入胶体。
5.观察:
当核酸样品移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。电泳结束后,利用紫外灯观察DNA片段的迁移情况。当DNA样品在凝胶内移动到合适的距离时,关闭电源,去除电泳导线和电泳槽盖子。在室温下,用电泳缓冲液或水配制的EB溶液(0.5 μg/ml)对凝胶进行染色
。
三、琼脂糖凝胶电泳的主要应用
1.DNA片段的鉴定:
通过比较DNA片段的迁移距离,与标准品进行对照,可以判断DNA片段的大小。
2.DNA片段的分离:
利用不同大小DNA片段的迁移速率差异,可以将DNA片段进行分离。
3.DNA的纯化:
通过电泳将目的DNA片段与其他杂质分离,得到纯化的DNA片段。(割胶回收)
四、操作技巧和注意事项
1.EB毒性
EB是一种很强的诱变剂。在接触含有EB溶液时,应该全程戴手套和口罩。
电泳中使用的溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。
2. 加热熔化琼脂糖
用微波炉加热熔化琼脂糖时,溶液体积不能超过三角瓶容量的1/3,以免煮沸时溶液溢出。同时,琼脂糖必须完全熔化,否则可能导致电泳图像模糊不清。
3.凝胶厚度
凝胶的厚度一般为4-6nm,若太厚可能会影响检测的灵敏度。待凝胶充分凝固后才能拔出梳子,以保证点样孔形状完好,防止漏样。
4.上样
上样时,须先除去点样孔中的气泡,并且加样操作需小心谨慎,以免漏样或损坏胶孔。
5.电泳电压
选择适当的电泳运行条件很重要,包括电压和距离。推荐的电压范围是4-6V/cm,电压太低会降低迁移率,电压太高会降低分辨率。
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