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【金秋计划】大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化

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2024/09/06

食品常规理化分析

大肠杆菌宿主菌株作为受体细胞，当这些受体细胞经过(CaCl₂)处理时，它们的细胞膜通透性会发生暂时性的改变，从而成为能够允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

一、感受态细胞

1.感受态：受体细胞最容易接受外源基因并将其转化的一种生理状态。2.感受态细胞：受体细胞通过理化方法处理，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。3.感受态菌龄：细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态和实现成功转化的关键。

4.质粒转化：质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。

二、感受态细胞制备的原理

1.外源基因表达的条件：重组质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。2.感受态制备原理：将快速生长的大肠杆菌置于经低温0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（渗透作用），同时，Ca²⁺会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。3.质粒转化原理：感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激90s，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。

4.外源基因表达：进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将转化后的细胞在选择性培养基上（相应抗生素抗性）培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

三、感受态细胞的制备（CaCl₂法）

1. 受体菌种活化：取-80℃冰箱中保藏的菌株（如DH5α、Top10、DE3、BL21等）在LB平板（无抗性）上划线分离，放置于37℃恒温培养箱中倒置培养。2. 受体菌培养：从LB平板上挑取单菌落，接种于10mLLB液体培养基中，37℃震荡培养12h左右至对数生长中后期。3. 菌种的准备：将受体菌菌悬液以2%的接种量接种于装有20mLLB液体培养基（无抗性）中，37℃震荡培养大约2-3h至OD600=0.4-0.5，菌落数＜10⁸cfu/mL。

4. 感受态细胞的制备：(1)离心：把上述菌液转移至1.5mL离心管中，冰浴10min，在4℃，3000r/min，离心10min。(2)重悬冰浴：弃上清液，加入10mL预冷的0.05M 的CaCl₂溶液，轻轻混匀，冰浴30min后，在4℃，3000r/min，离心10min。(3)重悬：弃上清，加入6mL预冷的含15%甘油的0.05MCaCl₂溶液，轻轻混匀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。或弃上清，加入6mL预冷0.05MCaCl₂溶液，轻轻混匀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液，直接使用。(4)分装：用移液枪分装重悬液至1.5mL离心管中，每个离心管中分装50μL悬浮液。(5)保藏：标记贴标签，使之迅速冷冻，-80℃保藏备用。
五、质粒化学转化1.取感受态：如果感受态细胞保藏于-80℃，从-80℃冰箱中取一支感受态，室温下解冻后立即冰浴；如果感受态细胞没有保藏，可以直接用于转化。2.质粒处理：一般质粒为粉末，1ng质粒添加10μL缓冲液或蒸馏水，混匀。3.转化：在含有50μL感受态细胞的离心管中加入1μL稀释后的标准质粒充分混匀，冰上静置30min。4.热击：将离心管置于42℃热击60-90s，然后迅速冰浴，使细胞冷却2-3 min。5.培养：向离心管中加入已预热的无菌LB培养基（无抗性）300μL，150rpm、37℃恒温震荡培养45min。6.涂布：吸取100μL菌液于LB固体培养基上（含抗性），用涂布器均匀涂布，放置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。
7.转化率计算：

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中菌落数可计算出转化子总数和转化效率，公式如下：

转化总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积

转化率=转化子总数/质粒DNA加入量μg

理论上转化率最高为每微克的标准质粒转化的菌落数为1×10¹⁰。

六、注意事项

1. 严格无菌操作

操作过程，注意进行无菌操作，避免环境中杂菌污染。

2.严格控制温度

操作过程，要注意操作温度，以保持细胞的状态；

加入抗生素时注意温度，避免过高温度导致抗生素失活。

3. 严格控制浓度

严格控制细胞的生长阶段和菌浓，严格控制质粒DNA的质量和浓度，以提高转化效率。

4. 计算转化率

记录和计算转化率的指标如转化子总数、感受态细胞总数和转化频率以评估转化效率。

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