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【金秋计划】芽孢染色法

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2024/09/06

食品常规理化分析

一、实验原理

1.适用范围：芽孢染色法适用于能够形成芽孢的各类芽孢杆菌。

2.原理：

(1)芽孢染色法属于复染色法，是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。

(2)芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
(3)芽胞具有高度的折光性，外膜致密，渗透性低，故普通染色法不易使其着色，芽胞染色法是根据芽胞既难以着色，而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个原则：采用着色力强的染料，并加热以促进标本着色，然后使菌体脱色，而芽胞上的染料仍保留，经复染后，菌体和芽胞呈现不同的颜色。

二、染液的配制

1.5%孔雀绿水溶液：孔雀绿5.0g，蒸馏水100mL。

2.0.5%番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。

三、应用

芽孢染色法是生物学和医学领域中常用的实验技术，用于观察和研究细胞的结构和功能。芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴别细菌的重要依据。

四、实验步骤

1.制片：取洁净的载玻片，在载玻片上滴加一滴生理盐水，然后用接种环蘸取少量芽孢菌跟水混匀，晾干，用酒精灯固定。

2.浸染：将固定好的涂片放入含5%孔雀绿水溶液的50℃水浴染色缸中，浸染15min。或者在涂片上滴加孔雀绿，用酒精灯加热，切勿干涸，要保持涂片湿润。

3.冲洗：取出载玻片，用水冲洗多余染液，直至出水无色为止。

4.复染：0.5%碱性番红复染1min。

5.冲洗：用水冲洗多余染液，直至出水无色为止，晾干。

6.镜检：先低倍镜找到区域后，换油镜观察芽孢和菌体。菌体呈红色或粉色，而芽孢呈绿色。

五、注意事项和操作技巧

1.选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。　　

2.加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。加热过程中要及时添加染色液，切勿让标本干涸。

3.芽孢观察也可以直接使用简单染色法。比如用番红或结晶紫染色后，芽孢不着色，菌体染色。

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