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【金秋计划】碱裂解法小规模提取质粒DNA分子
Ins_d6b56fa6
2024/09/06
私聊
食品常规理化分析
一、原理
碱裂解法提取质粒基于
线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异而达到分离目的。
在碱性条件下(pH值介于12.0-12.5),染色体DNA的双螺旋结构解开而变性,而质粒DNA虽然氢键断裂,但两条互补链仍紧密结合在一起。
当加入中和液(如pH4.8的KAc缓冲液)恢复中性时,质粒DNA迅速复性并保持可溶性状态,而染色体DNA则形成不溶性网状结构。通过离心,可将染色体DNA
、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,
与质粒DNA分离,最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
二、相关溶液的配制
1.
碱裂解溶液
I
50mL
葡萄糖,
25mM Tris-HCl(pH 8.0)
,
10mM EDTA
,115
℃
灭菌30min。
2.
碱裂解溶液
II
0.2N NaOH,1% SDS
(现配现用)。
3.
碱裂解溶液
(
pH 4.8
)
III
:
5M KAc60mL
,冰醋酸
11.5mL
,蒸馏水
28.5mL
。
4.
抗生素
5.
乙醇:
70%
和
95%
6.
饱和重蒸酚∶氯仿:异戊醇=
25:24:1
(v/v)
7.TE(pH8.0):
100mM Tris-HCl pH 8.0
,
10mM EDTA pH 8.0
。
8
.
STE
缓冲液
含有
20μg/L RnaseA
的
TE (pH8.0)
缓冲液
9
.LB
培养基(
Media
)(
g/L
)
蛋白胨
10g
,酵母膏
5g
,氯化钠
10g
,
pH7.5
。
三、详细操作步骤(大肠杆菌为例说明)
1.
活化菌种:
不同保藏方式要采用不同的活化方式,注意无菌操作。
2.
细菌培养:
挑取单菌落接种于液体培养基中(含抗生素),
37℃
振荡培养过夜。
不同的微生物培养方式不同
,注意液体培养基的体积不超过三角瓶容积的1/10
。
3.
收集细菌:
用
移液枪
将上述培养液加入
1.5mL
离心管中,
4°C
、
3000g/min
离心
1min
,去上清,收集菌体,尽可能地吸干水分,不能碰到沉淀。
(质粒存在于细菌内,收集菌体为了提取质粒。)
4.
洗涤:
用STE重悬菌体,离心后收集菌体,重复
2-3
次。
洗涤菌体
是为了去除杂质和残留物,?提高质粒的纯度和质量。
?
5.
碱裂解溶液 I:
加入
100μL
预冷的碱裂解溶液
I
并利用振荡器重悬菌体。
碱裂解溶液I的作用
是悬浮菌体,改变细胞膜的通透性。
葡萄糖
可以增加溶液的黏稠度,使菌体细胞不至于快速沉降。对提取质粒影响不大,可有可无;
Tris-HCl
控制溶液的pH;
EDTA
金属离子螯合剂,能够螯合细胞内所有
Ca
2+
、
Mg
2+
等二价金属离子,如果快速提取质粒的话,也可以不添加
EDTA
;
总结,如果没有碱裂解溶液
I
也可以进行质粒抽提。
6.
裂解液溶液Ⅱ:
向每个细菌重悬液内加入
200μL
新鲜配制的碱裂解溶液II,盖上试管,并快速倒置试管五次,冰浴
。
溶液Ⅱ的作用是使
DNA
变性,
SDS
的作用在于使细胞裂解,以释放出质粒
DNA
和染色体
DNA
,在高
pH(12.0~12.5)
条件下,破坏碱基配对,使
DNA变性。
NaOH
作用
是溶解细胞释放
DNA
。因为在强碱性的情况下,细胞膜磷脂双分子层发生结构变化,导致细胞裂解,
DNA
得到释放。氢氧化钠与
SDS
联用,还能够增强自身的强碱性。
SDS
作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜,从而释放出细胞内容物(
Lysate
),还可以使蛋白变性并结合到蛋白质表面,成为“
R-O-S03—…R
十-蛋白质”的复合物而使其沉淀下来。
在
pH
值
12.0-12.5
的碱性条件下,染色体
DNA
的氢键断裂、双螺旋结构解开并降解成片段,共价闭环的
质粒 DNA
虽然变性但仍处于拓扑缠绕。
注:不要用振荡器!防止基因组DNA断裂,从而影响目标产物的提取。
7.
裂解液溶液III:
加入
150μL
冰冷的碱裂解溶液III,盖上离心管,之后倒置数次以使溶液充分混合,之后冰浴
3-5min
。
溶液Ⅲ的作用是使
DNA
复性。
线状染色体
DNA
聚集成不可溶的网络状聚合物,而质粒
DNA
得以完全复性。同时高浓度的
KAc
会引起蛋白质-
SDS
复合物和高分子质量的
RNA
分子发生沉淀。
KAc
的作用
是沉淀蛋白质和宿主
DNA
,其原理是
K
+
置换
SDS
中的
Na
+
而形成
PDS
,而
PDS
是不溶水的,同时一个
SDS
分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。
冰醋酸的主要作用
是中和
NaOH
,调整缓冲液的
pH
值。
染色体
DNA
在改变缓冲液
pH
值后发生复性,但是无法恢复原来的天然双链结构,而是反应后形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构,同时高浓度的钾盐溶液可以让
SDS
-蛋白质-染色体DNA
复合物以沉淀析出。接下来通过高速离心,
SD
S-蛋白质-染色体
DNA
复合物、以及其他的细胞裂解物全部沉淀管底,最终只有质粒
DNA
溶解在上清中。
8. 离心:
把经过上述溶液处理的细菌裂解液在低温离心机上高速离心5min,之后把上清液小心转移至一离心管中。
(质粒DNA在上清中,染色体DNA在沉淀中。)
9. 除蛋白脂类等杂质:
加入等体积的酚-氯仿-异戊醇,通过震荡器使之充分混合。在
4°C
微型离心机上高速离心
2min
,把离心后上层水相转移至干净离心管。
酚-氯仿-异戊醇的主要作用
是分离DNA和杂质蛋白。?
酚的作用
主要体现在其强烈的蛋白质变性能力,?能有效使蛋白质变性而除去。?酚是强烈的蛋白质变性剂,?通过使蛋白质变性,?从而帮助去除蛋白质杂质,?使DNA和杂质蛋白得以分离。?
氯仿的作用
在于强烈的脂溶性和加快有机相与
液相
的分层能力。?氯仿有助于去除脂类杂质,?加快有机相与
液相
的分层。?
(上层水相含质粒DNA、中间变性蛋白相、下层有机溶剂相的稳定分层。)
10. 除盐:
室温下加入
2
倍体积的乙醇,沉淀核酸,通过振荡器打匀之后,室温下静置
2min
。
乙醇的作用
主要是去除溶液中的盐杂质,?以便去除,提高质粒的纯度。
(乙醇溶解杂质,在上清,质粒DNA在沉淀。)
11.
离心收集沉淀:通过高速离心机
4°C
离心
5min
,收集沉淀的核酸。
(质粒DNA在沉淀,收集沉淀。)
12.
按照试验步骤
3
所描述的方法,吸掉上清液。之后,把离心管倒置于纸巾上,使管内所有的液体流出。同时,可以利用枪头除去管壁上可能黏附的液滴。
(质粒DNA在沉淀。)
13. 洗涤:
加入
1
mL
70%
的乙醇,反复倒转离心管数次,之后于
4°C
离心机上高速离心
2
-
5min
。
继续洗去杂质,纯化质粒DNA。
14.
除上清:按照试验步骤
3
所描述的方法除去离心管中上清液。此过程要多加小心,以免因为核酸沉淀和管壁接合不牢而被吸去。
(质粒DNA在沉淀。)
15.
除乙醇:除去离心管侧壁上所有的乙醇液滴。把离心管开口置于室温直至其中乙醇都被蒸发掉,约需要
5-10min
。
这个过程不可时间过长,会导致DNA脱水而难以溶解并可能变性。
16.
贮存:把所制备的核酸溶于
50μLTE
(含有
20μg/mL
不含
Dnase
的
Rnase A
,
pH8.0
)缓冲液中,利用震荡器轻微震荡几秒钟,使核酸沉淀充分溶解。所制备
DNA
溶液贮存于
-20°C
内。
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