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【金秋计划】防己黄芪汤改善类风湿性关节炎的关键靶点和生物活性成分

城头变幻大王骑

2024/09/10

中药/天然药检测

类风湿性关节炎（RA）是一种严重的异质性自身免疫性疾病，防己黄芪汤（Fangji HuangqiDecoction，FHD）是一种用于治疗RA的经典中药复方，由4种草药（防己、黄芪、白术、甘草）组成，效果令人满意。FHD以其补气强外、祛风祛湿的能力而闻名，但其治疗RA的机制和生物活性化合物仍不清楚。

防己黄芪汤改善类风湿性关节炎的关键靶点和生物活性化合物，发现环氧合酶2（COX-2）是FHD改善RA的关键靶点，粉防己碱（Tetrandrine）负责FHD对RA作用的主要生物活性成分。机制上，粉防己碱与COX-2的Tyr385残基结合，抑制COX-2蛋白表达和抑制COX-2的酶催化活性，减少前列腺素和炎性代谢物的产生，发挥抗RA作用。此外，FHD的作用优于汉防己甲素，表明FHD 还含有其他化合物在FHD治疗RA时发挥作用，这体现了中医方剂治疗疾病的“多组分”特征。
Highlights

1）COX-2固定化磁珠的用于配体垂钓技术来识别作用于COX-2的生物活性成分；

2）粉防己碱（Tetrandrine）为防己黄芪汤（FHD）改善RA的生物活性成分；

3）FHD的作用优于Tetrandrine表明FHD可能包含其他成分与Tetrandrine协同作用。

1、COX-2蛋白是FHD治疗RA的关键靶点

作者首先通过网络药理学分析预测FHD改善RA的关键靶标，其中PTGS2为最核心靶点，COX-2是PTGS2基因编码的蛋白酶，可能是FHD改善RA的关键靶标，且已有报道表明COX-2是抗关节炎靶点，可以调节前列腺素的产生来抑制炎症。因此作者研究了FHD中作用于COX-2的生物活性成分

2、通过COX-2@MBs对FHD进行配体捕捞和分析

为了控制FHD提取液的质量，作者获得FHD提取液，质谱鉴定到23个特征峰，其中7个通过标准品确定为粉防己碱、防己诺林碱等。接着作者制备了cox-2固定化磁珠（COX-2@MBs），将其与FHD溶液共孵育，并用UPLC-MS分析洗脱液，鉴定出11种成分，其中7个在洗脱液中含量较高，通过标准品鉴定为粉防己碱、汉防己丙素、防己诺林碱、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草查尔酮B
3、体外筛选对COX-2酶活性有良好抑制作用的成分

利用商品化COX-2抑制剂筛选试剂盒，测定了7种含量较高的成分的IC50值，其中粉防己碱、汉防己丙素、防己诺林碱、甘草查尔酮BIC50值均小于200μM，防己诺林碱的IC50值最低，为17.25±1.16μM，表明这4种成分对COX-2酶活性有较强的抑制作用，是FHD中通过抑制COX-2治疗RA的潜在生物活性成分，但其抑制活性并不优于塞来昔布（celecoxib，对COX-2具有选择性抑制作用，已被用于治疗RA的一线药物，通过抑制COX-2 酶活性来抑制前列腺素的产生，从而有效缓解RA患者的炎症症状）。

4、体内筛选对急性关节炎症有抑制作用的成分

角叉菜胶诱导的急性水肿模型大鼠通常用于评价潜在的COX-2选择性抑制剂如塞来昔布对急性炎症的抑制作用，作者发现虽然这7种成分均能特异性地与COX-2结合，但只有粉防己碱一种成分不仅能抑制COX-2酶活性，还能抑制急性炎症
5、粉防己碱作为FHD的主要生物活性成分通过COX-2抑制胶原诱导性关节炎

心脏组织H&E染色结果显示粉防己碱不会引起CIA小鼠的心脏毒性（图5）。粉防己碱可减轻CIA小鼠的爪水肿，显著减轻关节炎症，改善CIA小鼠的爪子和关节骨质量，降低CIA小鼠踝关节COX-2水平。FHD显著改善了CIA小鼠的症状，降低CIA小鼠踝关节COX-2水平，表明COX-2是FHD治疗RA的关键作用靶点。

值得注意的是，FHD组与中、高剂量粉防己碱组的AI评分及血清IL-6水平差异均无统计学意义，但低剂量粉防己碱组的这两项指标显著低于FHD组。结果表明，虽然FHD煎剂（1.55 μg/mL）中粉防己碱的含量约为低剂量粉防己碱溶液（1.25 mg/mL）中粉防己碱的0.1%，但FHD对胶原诱导的足部水肿和血清IL-6表达的抑制作用优于低剂量粉防己碱。

此外，体外COX-2酶活性测定和体内角叉菜胶诱导的急性炎症试验结果表明，单独使用其他捕获组分的生物活性作用远弱于同剂量粉防己碱。结果表明，FHD 中除了主要活性化合物粉防己碱外，还存在其他活性成分，可能与粉防己碱发挥协同作用，抑制RA，体现了中药方剂治病“多成分”特点
6、粉防己碱与COX-2蛋白结合方式的分子对接

最后，作者通过计算机模拟优化COX-2蛋白和粉防己碱的三维结构，研究了配体粉防己碱与受体COX-2的空间拟合度和能量匹配度，确定了它们的结合亲和力和结合模型。结合能为-7.35kcal/mol，粉防己碱与COX-2残基Thr212之间形成氢键。此外，粉防己碱与 COX-2 的残基 Tyr385结合，该位点被报道是COX-2 将花生四烯酸（AA）转化为前列腺素E2（PGE2）的酶催化位点之一。因此，作者推断粉防己碱竞争性地占据了AA在COX-2蛋白上的结合位点，从而减少前列腺素和炎性代谢物的产生，最终实现其抗类风湿关节炎作用

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