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【金秋计划】丹酚酸B靶向神经氨酸酶NEU1改善肾纤维化
城头变幻大王骑
2024/09/12
私聊
中药/天然药检测
1、慢性肾脏病患者肾小管上皮细胞(TEC)中NEU1升高
作者首先通过分析肾脏转录组学数据库检测神经氨酸酶(NEU1-NEU4)的表达,发现肾活检组织中NEU1而非NEU2-NEU4的mRNA显著上调,NEU1在大多数类型的CKD(IgA、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等)中升高。此外,作者纳入临床样本发现肾纤维化患者的NEU1蛋白水平显著高于无肾纤维化患者,NEU1含量的增加主要与肾损伤分子1(KIM1)共定位,NEU1表达与肾小球滤过率呈负相关。
2、NEU1在小鼠纤维化肾脏中上调
接下来,作者测定了小鼠中NEU1的蛋白水平,通过单侧输尿管梗阻(UUO)或叶酸刺激建立肾纤维化模型,发现NEU1 mRNA和蛋白水平在纤维化小鼠的肾脏中显著增加,肾脏切片的染色显示NEU1在TEC中的定位增加。此外,NEU1的水平与纤维化指数呈正相关。进一步在TEC中敲低/过表达究NEU1来研究NEU1在TEC损伤中的作用,发现NEU1介导的TGFβ诱导的HK-2细胞上皮/间质标志物改变。
3、TEC特异性NEU1缺失抑制小鼠肾纤维化
为了研究 NEU1 在肾纤维化中的作用,作者构建了TEC 特异性缺失Neu1的小鼠,通过单侧输尿管梗阻(UUO),发现NEU1敲除显著改善了形态,减少胶原沉积,抑制肾小管坏死和肾小管间质炎症,抑制巨噬细胞浸润和肾小管细胞中的pNF-κB,抑制UUO 诱导的KIM1 表达,抑制了EMT进展,抑制了UUO诱导的炎症细胞因子水平。
在另一种由叶酸诱导的肾纤维化模型中,Neu1CKO小鼠的形态和肾重也明显改善,NEU1敲低显著改善肾功能相关肌酐和血尿素氮水平,抑制叶酸诱导的KIM1表达,减少肾小管损伤和间质纤维化。巨噬细胞浸润,EMT标记基因表达,促炎细胞因子,纤维化因子等均由于肾小管上皮细胞中NEU1缺乏而明显逆转。
4、NEU1过表达增强UUO诱导的小鼠肾纤维化
除功能丧失外,作者还使用AAV9-NEU1将其注射到小鼠的肾皮层中进行NEU1过表达,免疫荧光结果显示AAV9-NEU1成功转导到TEC中。此外,NEU1过表达加剧了UUO诱导的肾脏萎缩,管状膨胀和胶原蛋白在肾脏皮质和髓质中的沉积,增强了UUO诱导的KIM1表达和肾脏中的EMT进展,增加了UUO刺激的巨噬细胞浸润,促炎细胞因子,纤维化因子的表达。
5、NEU1与ALK5在160–200区域相互作用
为了深入研究NEU1促进肾纤维化的潜在机制,作者通过
PCR
芯片检测差异表达基因,前三位富集的KEGG通路包括TGF-β信号通路,由于TGFβ是驱动CKD中EMT和纤维化的主要致病因素,作者以TGF-β信号通路为中心。通过测试NEU1与TGF-β受体直接互作的可能性,Co-IP发现NEU1选择性地与ALK5结合,但不能与ALK2、ALK3等受体结合。Co-IP结合质谱法确认NEU1与ALK5的相互作用,免疫荧光显示NEU1与ALK5共定位于人纤维化肾脏。此外,双分子荧光互补(BiFC)以及原位邻位连接测定(PLA)均验证了NEU1和ALK5在患者纤维化肾中的直接相互作用。进一步SPR、PLA和Co-IP确定了ALK5的特异性结合域,证实NEU1与ALK5在160–200区域相互作用。
6、NEU1与ALK5互作并稳定ALK5以增强 ALK5-SMAD2/3信号通路
为了研究NEU1-ALK5互作对ALK5的影响,作者测量了ALK5在存在或不存在NEU1的情况下的稳定性,发现NEU1敲低促进ALK5降解,而NEU1过表达抑制ALK5降解,表明NEU1与ALK5相互作用并稳定ALK5。ALK5 能够磷酸化其底物SMAD家族,作者发现NEU1沉默显著抑制TGFβ诱导的SMAD2/3激活,而NEU1过表达在TGFβ存在下维持SMAD2/3连续激活。此外,酶活性位点(mtNEU1:D103A、Y370A、E394A)的突变降低了NEU1过表达对TGFβ诱导的ALK5-SMAD2/3激活的影响,这些结果表明,NEU1与细胞质中ALK5的GS 结构域(氨基酸160-200)互作,然后增强ALK5-SMAD2/3信号通路,导致肾纤维化。
7、丹酚酸B靶向 NEU1保护肾脏
为了鉴定靶向NEU1的候选化合物,作者采用SPR筛选了来自药用植物的74种天然产物与重组人NEU1蛋白的结合亲和力,发现NEU结合亲和力最强的前两种化合物是来自丹参的丹酚酸B和和迷迭香酸中的迷迭香酸。Co-IP和PLA实验表明丹酚酸B显著抑制NEU1与ALK5之间的相互作用,TGFβ诱导的ALK5-SMAD2/3信号通路激活也被丹酚酸B阻断。随后,作者在小鼠模型中研究了丹酚酸B对肾损伤的保护作用,证实丹酚酸B可显著减轻UUO诱导的肾损伤和肾纤维化,抑制Kim1、Snai1和Snai2表达,抑制促炎细胞因子的产生,抑制ALK5的磷酸化和SMAD2/3的下游磷酸化,在缺血/再灌注诱导的小鼠模型中复制了丹酚酸B对肾损伤的保护作用。
为了测试NEU1是否介导丹酚酸B的保护作用,作者采用了Neu1 CKO小鼠模型,发现在Neu1 CKO小鼠中,丹酚酸B的治疗未能进一步减少UUO刺激下的肾损伤和肾纤维化,不能进一步抑制UUO诱导的Kim1表达。此外,在Neu1CKO小鼠中,丹酚酸B处理对ALK5磷酸化的抑制作用没有进一步增强。这些数据表明NEU1是保护肾脏的丹酚酸B所必需的。
总结
研究揭示了NEU1在慢性肾病中的新功能、新机制、新药物。研究人员首先基于临床样本、多种肾纤维化动物、细胞模型,发现NEU1在肾纤维化中过度活化。应用免疫荧光技术检测,发现高表达的NEU1主要定位在肾小管上皮细胞中。进一步构建了肾小管上皮细胞特异性NEU1敲除和过表达小鼠,在单侧输尿管结扎(UUO)和叶酸(FA)刺激模型下,敲除NEU1抑制上皮-间质转化、炎细胞因子产生和胶原沉积,从而改善肾纤维化、对抗肾损伤;相反,过表达NEU1则加重UUO诱导的肾纤维化。采用
PCR
array、Co-IP、BiFC、PLA等技术手段发现NEU1选择性结合TGFβ I型受体ALK5,截短质粒、SPR技术明确NEU1与ALK5的160-200氨基酸区域结合,从而稳定ALK5,促使ALK5-Smad2/3信号通路持续激活,诱发肾纤维化发生发展。研究人员进一步以人源NEU1为靶点,从中药中筛选具有肾脏保护作用的活性成分。从近百个中药单体化合物中发现中药丹参中的丹酚酸B与人源NEU1重组蛋白具有极强亲和力;通过动物水平研究,明确了丹酚酸B抑制NEU1、对抗ALK5-Smad2/3通路激活改善肾纤维化,利用NEU1敲除小鼠,证实丹酚酸B依赖于NEU1对抗肾损伤,为揭示丹参发挥肾保护作用的科学内涵提供直接靶点证据,也为靶向NEU1途径治疗慢性肾病的临床应用和药物研发开拓了新方向。
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