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【金秋计划】丹酚酸B靶向神经氨酸酶NEU1改善肾纤维化

城头变幻大王骑

2024/09/12

中药/天然药检测

1、慢性肾脏病患者肾小管上皮细胞（TEC）中NEU1升高

作者首先通过分析肾脏转录组学数据库检测神经氨酸酶（NEU1-NEU4）的表达，发现肾活检组织中NEU1而非NEU2-NEU4的mRNA显著上调，NEU1在大多数类型的CKD（IgA、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等）中升高。此外，作者纳入临床样本发现肾纤维化患者的NEU1蛋白水平显著高于无肾纤维化患者，NEU1含量的增加主要与肾损伤分子1（KIM1）共定位，NEU1表达与肾小球滤过率呈负相关。

2、NEU1在小鼠纤维化肾脏中上调

接下来，作者测定了小鼠中NEU1的蛋白水平，通过单侧输尿管梗阻（UUO）或叶酸刺激建立肾纤维化模型，发现NEU1 mRNA和蛋白水平在纤维化小鼠的肾脏中显著增加，肾脏切片的染色显示NEU1在TEC中的定位增加。此外，NEU1的水平与纤维化指数呈正相关。进一步在TEC中敲低/过表达究NEU1来研究NEU1在TEC损伤中的作用，发现NEU1介导的TGFβ诱导的HK-2细胞上皮/间质标志物改变。

3、TEC特异性NEU1缺失抑制小鼠肾纤维化

为了研究 NEU1 在肾纤维化中的作用，作者构建了TEC 特异性缺失Neu1的小鼠，通过单侧输尿管梗阻（UUO），发现NEU1敲除显著改善了形态，减少胶原沉积，抑制肾小管坏死和肾小管间质炎症，抑制巨噬细胞浸润和肾小管细胞中的pNF-κB，抑制UUO 诱导的KIM1 表达，抑制了EMT进展，抑制了UUO诱导的炎症细胞因子水平。

在另一种由叶酸诱导的肾纤维化模型中，Neu1CKO小鼠的形态和肾重也明显改善，NEU1敲低显著改善肾功能相关肌酐和血尿素氮水平，抑制叶酸诱导的KIM1表达，减少肾小管损伤和间质纤维化。巨噬细胞浸润，EMT标记基因表达，促炎细胞因子，纤维化因子等均由于肾小管上皮细胞中NEU1缺乏而明显逆转。

4、NEU1过表达增强UUO诱导的小鼠肾纤维化

除功能丧失外，作者还使用AAV9-NEU1将其注射到小鼠的肾皮层中进行NEU1过表达，免疫荧光结果显示AAV9-NEU1成功转导到TEC中。此外，NEU1过表达加剧了UUO诱导的肾脏萎缩，管状膨胀和胶原蛋白在肾脏皮质和髓质中的沉积，增强了UUO诱导的KIM1表达和肾脏中的EMT进展，增加了UUO刺激的巨噬细胞浸润，促炎细胞因子，纤维化因子的表达。

5、NEU1与ALK5在160–200区域相互作用

为了深入研究NEU1促进肾纤维化的潜在机制，作者通过PCR芯片检测差异表达基因，前三位富集的KEGG通路包括TGF-β信号通路，由于TGFβ是驱动CKD中EMT和纤维化的主要致病因素，作者以TGF-β信号通路为中心。通过测试NEU1与TGF-β受体直接互作的可能性，Co-IP发现NEU1选择性地与ALK5结合，但不能与ALK2、ALK3等受体结合。Co-IP结合质谱法确认NEU1与ALK5的相互作用，免疫荧光显示NEU1与ALK5共定位于人纤维化肾脏。此外，双分子荧光互补（BiFC）以及原位邻位连接测定（PLA）均验证了NEU1和ALK5在患者纤维化肾中的直接相互作用。进一步SPR、PLA和Co-IP确定了ALK5的特异性结合域，证实NEU1与ALK5在160–200区域相互作用。

6、NEU1与ALK5互作并稳定ALK5以增强 ALK5-SMAD2/3信号通路

为了研究NEU1-ALK5互作对ALK5的影响，作者测量了ALK5在存在或不存在NEU1的情况下的稳定性，发现NEU1敲低促进ALK5降解，而NEU1过表达抑制ALK5降解，表明NEU1与ALK5相互作用并稳定ALK5。ALK5 能够磷酸化其底物SMAD家族，作者发现NEU1沉默显著抑制TGFβ诱导的SMAD2/3激活，而NEU1过表达在TGFβ存在下维持SMAD2/3连续激活。此外，酶活性位点（mtNEU1：D103A、Y370A、E394A）的突变降低了NEU1过表达对TGFβ诱导的ALK5-SMAD2/3激活的影响，这些结果表明，NEU1与细胞质中ALK5的GS 结构域（氨基酸160-200）互作，然后增强ALK5-SMAD2/3信号通路，导致肾纤维化。

7、丹酚酸B靶向 NEU1保护肾脏

为了鉴定靶向NEU1的候选化合物，作者采用SPR筛选了来自药用植物的74种天然产物与重组人NEU1蛋白的结合亲和力，发现NEU结合亲和力最强的前两种化合物是来自丹参的丹酚酸B和和迷迭香酸中的迷迭香酸。Co-IP和PLA实验表明丹酚酸B显著抑制NEU1与ALK5之间的相互作用，TGFβ诱导的ALK5-SMAD2/3信号通路激活也被丹酚酸B阻断。随后，作者在小鼠模型中研究了丹酚酸B对肾损伤的保护作用，证实丹酚酸B可显著减轻UUO诱导的肾损伤和肾纤维化，抑制Kim1、Snai1和Snai2表达，抑制促炎细胞因子的产生，抑制ALK5的磷酸化和SMAD2/3的下游磷酸化，在缺血/再灌注诱导的小鼠模型中复制了丹酚酸B对肾损伤的保护作用。

为了测试NEU1是否介导丹酚酸B的保护作用，作者采用了Neu1 CKO小鼠模型，发现在Neu1 CKO小鼠中，丹酚酸B的治疗未能进一步减少UUO刺激下的肾损伤和肾纤维化，不能进一步抑制UUO诱导的Kim1表达。此外，在Neu1CKO小鼠中，丹酚酸B处理对ALK5磷酸化的抑制作用没有进一步增强。这些数据表明NEU1是保护肾脏的丹酚酸B所必需的。

总结

研究揭示了NEU1在慢性肾病中的新功能、新机制、新药物。研究人员首先基于临床样本、多种肾纤维化动物、细胞模型，发现NEU1在肾纤维化中过度活化。应用免疫荧光技术检测，发现高表达的NEU1主要定位在肾小管上皮细胞中。进一步构建了肾小管上皮细胞特异性NEU1敲除和过表达小鼠，在单侧输尿管结扎（UUO）和叶酸（FA）刺激模型下，敲除NEU1抑制上皮-间质转化、炎细胞因子产生和胶原沉积，从而改善肾纤维化、对抗肾损伤；相反，过表达NEU1则加重UUO诱导的肾纤维化。采用PCR array、Co-IP、BiFC、PLA等技术手段发现NEU1选择性结合TGFβ I型受体ALK5，截短质粒、SPR技术明确NEU1与ALK5的160-200氨基酸区域结合，从而稳定ALK5，促使ALK5-Smad2/3信号通路持续激活，诱发肾纤维化发生发展。研究人员进一步以人源NEU1为靶点，从中药中筛选具有肾脏保护作用的活性成分。从近百个中药单体化合物中发现中药丹参中的丹酚酸B与人源NEU1重组蛋白具有极强亲和力；通过动物水平研究，明确了丹酚酸B抑制NEU1、对抗ALK5-Smad2/3通路激活改善肾纤维化，利用NEU1敲除小鼠，证实丹酚酸B依赖于NEU1对抗肾损伤，为揭示丹参发挥肾保护作用的科学内涵提供直接靶点证据，也为靶向NEU1途径治疗慢性肾病的临床应用和药物研发开拓了新方向。

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