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毛花猕猴桃可培养内生真菌菌群结构、多样性及生物活性分析

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

毛花猕猴桃Actinidia eriantha Benth.系猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属植物，干燥根入药，俗称白山毛桃根，临床多用于治疗胃癌、结肠癌、肝硬化、慢性肝炎、白血病、直肠脱垂、疝气和子宫脱垂等[1]。白山毛桃根是常用畲药之一，在畲药常用处方中占比达15%[2]。现代药理学研究表明，白山毛桃根具有抗肿瘤、保护神经、抗氧化、抗炎等药理活性，特别是其可通过诱导细胞凋亡和坏死、免疫调节、阻滞细胞周期等方式，抑制癌细胞生长[1]。毛花猕猴桃种质资源丰富，广泛分布在浙江、江西、福建、湖南等广大丘陵地区[3]。目前，毛花猕猴桃已经实现了人工栽培，在浙江丽水等地有较大面积的种植，但毛花猕猴桃种植过程中存在根腐病、溃疡病等病害，对毛花猕猴桃产业发展造成较大影响。
植物内生真菌指的是其生存的部分阶段或全过程存在于健康植物的组织和器官中，且不会给健康植物带来不良反应的真菌[4]。植物内生真菌与宿主植物长期协同进化，保持着互利共生的关系。稳定的植物内生真菌菌群结构与多样性，是保证植物正常生长发育及其对环境胁迫适应的基础[5]。因此，研究药用植物内生真菌的菌群结构与多样性，有利于实现药用植物微生物资源的有效利用，为药用植物资源的开发利用及中药产业发展提供研究思路。
目前，对毛花猕猴桃的研究多集中在药理活性[6-7]、化学成分[8]、栽培技术[3]等方面，有关毛花猕猴桃的内生真菌菌群结构、多样性及其活性分析相关研究较少，毛花猕猴桃内生真菌资源未得到充分开发。因此，本实验通过分离鉴定毛花猕猴桃可培养内生真菌，分析其菌群结构与多样性，并进行菌株促生与病原菌拮抗等活性分析，筛选活性菌株，以期为毛花猕猴桃高效优质栽培提供内生真菌资源。
1 材料与试剂
1.1 材料
2021年11月，采集浙江省丽水市毛花猕猴桃健康新鲜植株，经浙江中医药大学刘考铧鉴定为猕猴桃科多年生藤本植物毛花猕猴桃Actinidia eriantha Bentham。拟南芥种子（型号Col-0）由浙江大学董伟国博士惠赠。麦根腐平脐蠕孢病菌Bipolaris sorokiniana Shoemaker，胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.，刺盘孢炭疽菌Colletotrichum camelliae Massee，核盘菌Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary，腐皮镰刀菌Fusarium solani (Martius) Saccardo，立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kuhn，尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum sensu Smith & Swingle，葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea (Moug.) Ces. & De Not.均取自本实验室菌种资源库。
1.2 试剂与仪器
1/2MS培养基（含糖琼脂1/2MS 40.47 g，pH 5.8～6.0），PDA培养基（马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15～18 g/L，pH自然），SW-CJ-1D超净工作台（苏州净化有限公司），Takara9770A和RR003A试剂盒（Takara公司），ABI（Proflex）型PCR仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），GelDocXR凝胶成像仪（北京科誉兴业科技发展有限公司），LM I-100型霉菌培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）、RXZ-500A型智能人工气候箱（宁波江南仪器厂）、V20型蔡司体式显微镜（德国Carl1 Zeiss AG集团）。
2 方法
2.1 内生真菌的分离、纯化与ITS分子鉴定
参考吴婷等[9]的方法进行毛花猕猴桃内生真菌的分离与纯化。根据菌丝、菌落与形态特征，将内生真菌划分为不同形态型。按照王景暄等[10]的方法提取内生真菌DNA与系统发育树分析的构建。采用ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAAGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作为通用引物进行PCR扩增，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，后送至上海生工生物有限公司进行测序。
2.2 内生真菌菌群结构与多样性分析
分离率（isolation rate，IR）指某个指定类型的内生真菌菌株数占分离样本组织块总数的百分比；相对频率（relative frequency，RF）指某一内生真菌的菌株数占分离总菌株数的比率。优势菌群判定：Pi为内生真菌i的RF，S为每个器官内生真菌种类数，当Pi＞1/S时即i为优势菌群[11]。以根、茎、叶为分类单位，采用Shannon-Wiener多样性指数（H’）和Simpson多样性指数（I）分析内生真菌的生物多样性；采用Pielou均匀度指数（E）分析同一物种不同部位物种分布的均匀性；采用Sorenson相似性系数（Cs）比较不同部位内生真菌物种组成的相似性[12]。
2.3 毛花猕猴桃内生真菌对拟南芥促生作用
参考杜疏炀等[13]的方法，将长至1.5 cm左右的拟南芥幼苗转接至1/2MS培养基，并接种内生真菌菌饼，进行内生真菌与拟南芥的共培养。采用直尺和电子天平测定拟南芥的根长、鲜质量等生长性状指标，运用蔡司体视显微镜观察拟南芥根毛及叶片状况。
2.4 毛花猕猴桃内生真菌对病原菌的拮抗作用
采用平板对峙法[14]，将病原菌菌饼置于PDA平板中心，同时在120°方向距中心2.25 cm处接种3个内生真菌菌饼，进行病原菌拮抗实验。以哈茨木霉菌作为阳性对照组，测量病原菌的生长半径，并计算相对抑制率，实验平行3次。
相对抑制率＝(对照病原菌菌落直径－对峙病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径[15]
2.5 数据分析
采用IBM SPSS Statistics 27.0软件进行单因素方差（ANOVA检验）分析。
3 结果与分析
3.1 毛花猕猴桃内生真菌菌群结构与分布情况
共分离得到毛花猕猴桃内生真菌2 446株，其中，根787株，茎946株，叶713株。IR从高到低为茎＞根＞叶（IR依次为16.77%、13.95%、13.50%）。结果表明，毛花猕猴桃内生真菌的生长、侵染程度以及分布情况因宿主组织部位（根、茎、叶）的不同而存在差异。进一步纯化得到内生真菌156个形态型，经过ITS分子鉴定后确定为49个分类单元。其中33个分类单元鉴定到种水平（占比67.35%），16个分类单元到属水平（占比32.65%）（表1）。49个分类单元归属到真菌界3门5纲10目14科18属。其中大部分分类单元归属于子囊真菌门（Ascomycota，RF＝94.89%），少数分类单元属于担子菌门（Basidiomycota，RF＝3.97%）与毛霉门（Mucoromycota，RF＝1.14%）。
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不同组织部位的内生真菌分布存在差异。在目水平，根、茎、叶的内生真菌优势目均为肉座菌目（Hypocreales，RF＝47.01%、43.44%、47.12%）与散囊菌目（Eurotiales，RF＝33.29%、35.94%、31.28%）；但在属水平存在差异，根和叶的优势属为木霉属（Trichoderma，RF＝32.40%、22.02%）、聚孢霉属（Clonostachys，RF＝9.022%、12.90%）、篮状菌（Talaromyces，RF＝11.05%、9.68%）、青霉菌属（Penicillium，RF＝17.53%、16.41%），茎的优势属为木霉属（Trichoderma，RF＝26.96%）、聚孢霉属（Clonostachys，RF＝15.96%）、篮状菌（Talaromyces，RF＝11.94%）、青霉菌属（Penicillium，RF＝16.81%）、曲霉属（Aspergillus，RF＝7.19%）（图1-A）。在种水平，Trichoderma spirale是根的特有种，Bionectria ochroleuca是茎的特有种，Trichoderma koningiopsis是根与茎的共有种，其余30种真菌均为根、茎、叶的共有种（图1-B）。
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采用Cs来比较毛花猕猴桃不同组织部位内生真菌物种组成的相似程度。经计算，不同组织部位的Cs在0.957～0.967。结果表明，3种不同组织部位的内生真菌物种组成的相似程度均较高，物种分布相对一致。其中叶与根、叶与茎的物种相似程度最高且数值一致，根与茎的物种相似程度最低，详见表2。
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3.2 毛花猕猴桃内生真菌多样性分析
毛花猕猴桃不同组织部位内生真菌多样性存在差异。内生真菌H’指数为3.690 2～3.778 1，以茎的多样性指数最高，叶的多样性指数最低。D值为0.996 5～0.997 8，以叶的多样性指数最高，茎的多样性指数最低。E值0.971 0～0.981 3，茎的均匀度较高，根的均匀度较低。结果表明，从同一种植物体中不同的组织部位分离得到的内生真菌多样性存在差异，为今后进行内生真菌活性研究提供了良好的菌种资源，见表3。
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3.3 毛花猕猴桃内生真菌对拟南芥促生活性
内生真菌与拟南芥共培养14 d后，65.31%的内生真菌菌丝会覆盖拟南芥，造成拟南芥枯萎死亡；22.45%的真菌未覆盖拟南芥，但拟南芥叶片发黄，侧根数量少；12.24%的真菌共生后，拟南芥长势正常（图2-A）。对拟南芥的鲜质量与鲜质量增长率进行统计学分析，结果表明，91.84%的真菌对拟南芥生长有抑制作用；而内生真菌AE156、AE16、AE174、AE132处理后，拟南芥鲜质量增加，增长率依次为18.48%、37.13%、30.99%与17.02%。方差分析显示AE16（Clonostachys sp.）与空白对照组（CK）存在显著性差异（P＜0.05），平均鲜质量为（0.152±0.014 1）g，为CK组的1.37倍（图2-B）。将筛选出的有促生作用的生长良好的拟南芥与明显抑制生长、枯萎的拟南芥进行根部与叶片的显微观察，见图3。由图可见，与AE16共生的拟南芥根毛较为茂盛，叶片绒毛较多，拟南芥生长势良好；而AE06组抑制拟南芥生长，根部鲜见根毛，叶片皱缩枯烂，无绒毛且有菌丝缠绕。
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3.4 毛花猕猴桃内生真菌对病原菌的拮抗活性
在49株真菌里，87.76%的真菌对5种以上的病原菌均有抑制作用，其中有34株真菌对8种病原菌均有抑制作用。34株真菌来自17个不同的属，包括木霉属、聚孢霉属、淡紫拟青霉菌属、白僵菌属、拟青霉属等，见表4。其中，与阳性对照组相比有显著抑菌作用的菌株有11株（10株属于木霉属，1株属于白僵菌属）。木霉属AE175对立枯丝核菌有显著抑制效果；木霉属AE137、AE175及白僵菌属AE05对尖孢镰刀菌有显著抑制效果；木霉属AE03、AE20、AE23、AE67、AE80、AE137、AE151、AE169、AE175、AE194对葡萄座腔菌均有显著抑制效果；其中，AE175对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、葡萄座腔菌3种病原菌抑菌作用最强，IR依次为95.93%、88.57%、92.69%，见图4。
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4 讨论
本研究首次从畲药毛花猕猴桃分离得到内生真菌2 446株（根787株，茎946株，叶713株），通过形态学特征与分子鉴定方法确定为49个分类单元，归属于真菌界3门5纲10目14科18属。在不同组织部位中，叶与根、叶与茎的相似度最高且一致，根与茎的相似度最低。相似度的高低水平体现不同部位内生真菌的种类与分布规律存在差异。毛花猕猴桃根、茎、叶组织部位存在共有内生真菌30种，其中Trichoderma spirale是根的特有种，Bionectria ochroleuca是茎的特有种。
毛花猕猴桃内生真菌H′值以茎最高，D值以叶最高，均匀度指数以茎最高。多样性、丰富度等指数表明毛花猕猴桃的内生真菌资源较丰富。3个组织部位的最优势属为木霉属Trichoderma、聚孢霉属Clonostachy、篮状菌Talaromyces、青霉菌属Penicillium、曲霉属Aspergillus。木霉属、聚孢霉属、青霉菌属、曲霉属均可作为生物防治剂，拮抗植物病原体与诱导植物抗病性，已应用于中药材、农林等生产领域[16-21]，如拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis可以调控水杨酸和茉莉酸合成和信号途径关键基因表达，进而提高番茄植株的枯萎病抗病性[22]；篮状菌Talaromyces作为腐生霉菌分布于植物根、叶部，通过土壤腐殖质、溶解钾长石与磷酸钙等方式，促进植物生长[23]。
本实验从49种内生真菌中筛选出1株能显著促进拟南芥生长的菌株AE16，鉴定为Clonostachys sp.。Clonostachys sp.为聚孢霉属真菌，普遍定殖于植物的根、叶和花等器官中，通过加速生根、增大叶片等方式促进植物生长并提高产量[18]。下一步可以从多组学及植物生理学等方面研究聚孢霉属促生活性的分子机制，为毛花猕猴桃药材产量提升提供参考依据。抗病活性筛选结果显示，87.76%的真菌对5种以上的病原菌均有抑制作用，69.39%对8种病原菌均有抑制作用。与阳性对照组有显著差异的有11株（包括木霉属与白僵菌属），其中抑菌作用最强的为AE175，鉴定为Trichodermasp.，能够显著抑制尖孢镰刀菌、立枯丝核菌与葡萄座腔菌的生长。木霉属真菌诱导植物提升对微生物病害的抵御能力，促进植物生长，高效减少微生物病害对种植造成的损失。如木霉属真菌可以用于由尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、葡萄座腔菌等引起的根腐病、软腐病防治，在药材栽培与生产领域具有广泛应用价值[24-27]。
本研究对毛花猕猴桃内生真菌的菌群结构及生物活性进行了分析，但是采样地较为单一，同时分离方法为传统分离法，可能会导致部分内生真菌未得到充分分离，下一步可进一步优化实验设计，通过增加样地，改用高通量分离方法[28]等方式，充分挖掘毛花猕猴桃内生真菌资源；对于得到的促生活性菌株AE16与强抑菌活性菌株AE175，可设计多引物进行菌种鉴定，进一步明确其分类学地位，并对其作用机制进行探讨，为毛花猕猴桃产业发展提供微生物工程菌株。

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