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【金秋计划】基于氨基酸成分的淡水珍珠及海水珍珠对比分析及近红外快速检测

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

珍珠作为代表性海洋中药，在我国有悠久的应用历史[1]，《中国药典》2020年版[2]记载珍珠为珍珠贝科动物马氏珠母贝Pteria martensii (Dunker)，蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii (Lea) 或褶纹冠蚌Cristaria plicata (Leach) 等双壳类动物受刺激形成的文石颗粒，具有安神定惊、明目消翳、解毒生肌、润肤祛斑的功效。珍珠由无机物质及有机质构成，有机质主要为蛋白及多肽类物质。据报道，珍珠蛋白提取物具备较高的抗氧化能力[3]，能够促进人晶状体上皮细胞的生长，对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞（normal lens epithelial cells，HLEC）氧化损伤具有保护作用[4]，珍珠壳角蛋白含有的多种氨基酸可提高免疫力、延缓衰老[5]，甘氨酸和甲硫氨酸可通过促进胶原蛋白再生而起到美容的作用[6]。因此，研究珍珠的氨基酸成分，对于珍珠应用于药物方面具有重要意义。
《中华海洋本草》[7]和《中草药彩色图谱》[8]中记载，淡水珍珠的主要来源是蚌科三角帆蚌或褶纹冠蚌等淡水珍珠蚌，海水珍珠的主要来源则为珍珠贝类。研究表明二者成分组成没有太大差异[9]。近年来，研究发现珍珠在免疫调节、伤口愈合、抗氧化衰老等方面具有药理活性，且淡水珍珠及海水珍珠的抗氧化能力有明显区别[10-11]，不同基原珍珠的质量差异，导致药效发挥的不稳定[12]。目前，珍珠质量控制研究多关注于碳酸钙、微量元素，而药效上的差异与珍珠有机质成分密切相关，因此，确定其差异性有机成分并建立快速检测方法，对于珍珠的合理利用及制定科学合理的珍珠质量标准具有重要意义。目前常见的珍珠鉴别方法有辐照法、微量元素含量差异法、X荧光光谱法、热重-差示扫描量热法等方法[13-18]，未见淡水珍珠与海水珍珠氨基酸含量差异对比分析的研究。因此，本研究收集淡水珍珠及海水珍珠样品，测定其氨基酸组成与含量，结合多种计量学方法辨析淡水珍珠与海水珍珠之间的差异性成分[19]，进而运用近红外光谱技术建立珍珠快速检测模型，为珍珠的质量控制提供依据，并为其深入开发提供技术手段。
1 材料
1.1 药材
收集不同地区珍珠样品108批，其中淡水珍珠70批，海水珍珠38批，样品信息见表1，淡水珍珠以“DSZZ＋批号”，海水珍珠以“HSZZ＋批号”进行命名，所有样品均经广西中医药大学韦松基教授鉴定，分别为珍珠贝科动物马氏珠母贝P. martensii (Dunker)，蚌科动物三角帆蚌H. cumingii (Lea)受刺激形成的珍珠。
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1.2 药品与试剂
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（德国赛卡姆公司，批号分别为02090119），冷冻剂（市售食盐与冰块按质量1∶3混合，实验室自制）；维生素C（德国赛卡姆公司，批号6005010CN）、天冬氨酸（Asp，批号DST190806-897）、谷氨酸（Glu，批号DST190702-078）、丝氨酸（Ser，批号DST190901-190）、甘氨酸（Gly，批号DST190508-068），精氨酸（Arg，批号DST190415-079）、苏氨酸（Thr，批号DS191010-135）、丙氨酸（Ala，批号DST190801-124）、酪氨酸（Tyr，批号DST191013-261）、缬氨酸（Val，批号DST190906-061）、异亮氨酸（Ile，批号DST190626-266）、亮氨酸（Leu，批号DST190908-112）、苯丙氨酸（Phe，批号DST190812-136）、赖氨酸（Lys，批号DST191013-108）均购自乐美天医药有限公司，质量分数大于98%；组氨酸（His，北京索莱宝科技有限公司，批号1117A025），质量分数均大于98%；水为去离子纯水。
1.3 仪器
S-433D型全自动氨基酸分析仪[赛卡姆（北京）科学仪器有限公司]，N-500型傅里叶变换近红外光谱仪（步崎公司），Microvap 118型氮吹仪（Organomation公司），DHG-9240 A型恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），SQP型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，DFT-100A型粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。
2 方法与结果
2.1 样品溶液制备
精密称定样品0.5 g，在水解管内加6 mol/L（0.1%苯酚）盐酸溶液10 mL，将水解管放入冷冻剂冷冻3～5 min，接真空泵抽真空（接近0 Pa），然后充入氮气重复抽真空3次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在（110±1）℃的电热鼓风恒温箱内，水解22 h，取出，冷却至室温，将水解液过滤至25 mL量瓶内，并用水少量多次冲洗水解管，定容至刻度，振荡混匀，滤过，吸取滤液2 mL进行干燥，干燥后残留物用1～2 mL水溶解，再干燥，最后蒸干，用pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液2 mL溶解后滤过，取续滤液，供仪器测定用。
2.2 氨基酸对照品溶液的制备
分别精密称取14种氨基酸对照品，以样品稀释液制成浓度适宜的对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液适量，配制成Asp、Ile、Thr、Leu、Ser、Tyr、Glu、Phe、Gly、His、Ala、Lys、Val、Arg的质量浓度分别为29.70、14.55、10.91、19.31、19.88、15.00、27.82、13.95、41.66、12.26、47.44、15.45、14.62、19.65 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，备用。
2.3 茚三酮衍生化溶液制备
用600 mL甲醇溶解20 g茚三酮，加入2 g苯酚，过0.45 μm有机系滤膜；加入400 mL钾钠缓冲液中，用氮气从底部吹大约3～5 min，加入还原剂维生素C，再用氮气从底部吹大约3～5 min，将此茚三酮溶液用氮气密封10 h（气压约50 kPa）后使用。
2.4 色谱条件与结果
分离柱为磺酸键合离子交换柱；流动相为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.45，A）-柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 10.85，B）-2% NaOH溶液（C）；体积流量0.45 mL/min；梯度洗脱（表2），进样量20 μL；柱温58 ℃。反应液：茚三酮衍生化溶液，体积流量0.25 mL/min；柱温130 ℃；检测波长570 nm。14种氨基酸对照品与DSZZ61珍珠样品的氨基酸色谱分离效果见图1。
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2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察取0.1、0.2、0.5、1、1.5、2 mL，制备成不同质量浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各20 μL，注入氨基酸分析仪，记录各浓度溶液的色谱图。以氨基酸浓度为横坐标（X），以氨基酸峰面积为纵坐标（Y），绘制14种氨基酸的标准曲线，回归方程、相关系数（r2）及线性范围见表3。结果表明，在样品线性范围范围内，14种氨基酸回归方程的r2均大于0.999 0，线性关系良好。
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2.5.2 精密度试验取DSZZ61珍珠样品，按“2.1”项方法制备样品溶液，按“2.4”项下测定，连续进样6次，记录色谱图。计算Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg峰面积的RSD分别为0.74%、0.86%、0.73%、0.85%、0.70%、0.71%、1.03%、1.11%、0.85%、1.04%、0.72%、1.55%、0.74%、1.20%，说明仪器精密度好。
2.5.3 稳定性试验取DSZZ61珍珠样品，按“2.1”项下方法制备样品溶液，按“2.4”项下条件测定，分别在0、4、8、12、16、20 h进样，记录色谱图。计算Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg峰面积的RSD分别为1.69%、1.11%、1.08%、1.20%、1.10%、1.06%、1.88%、1.03%、1.16%、1.34%、1.45%、1.94%、1.06%、1.41%，表明供试品溶液在20 h内稳定性好。

2.5.4 重复性试验取DSZZ61珍珠样品各6份，按2.1项下方法制备样品溶液，按“2.4”项下条件测定，记录色谱图。计算Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg的平均质量分数为0.19%、0.04%、0.14%、0.10%、0.44%、0.36%、0.06%、0.05%、0.10%、0.07%、0.09%、0.03%、0.06%、0.12%，RSD分别为1.15%、0.94%、1.07%、1.16%、0.76%、1.32%、1.79%、1.46%、1.49%、1.90%、1.39%、2.65%、1.98%、1.85%，表明方法的重复性好。
2.5.5 加样回收试验取DSZZ61珍珠样品各6份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入14种氨基酸对照品适量。按“2.1”项下方法制备14种氨基酸的加样回收的样品溶液，按“2.4”项下条件测定，14种氨基酸的加样回收率分别为98.69%、98.50%、99.36%、101.59%、109.62%、107.11%、94.56%、101.21%、97.52%、86.09%、101.08%、112.18%、97.11%、94.07%，RSD均小于2.0%，方法的准确度好。
2.6 氨基酸含量测定结果
对收集到的珍珠样品按“2.1”项下方法制备，氨基酸分析仪测定其含量。在108批珍珠供试品中，不同产地珍珠共计检测到14种氨基酸，淡水珍珠与海水珍珠中14种氨基酸的含量范围如表4所示。其中Gly、Ala、Asp 3种氨基酸含量较高，结合两者氨基酸含量范围，仅Gly、Asp含量范围无交集，见图2。
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2.7 淡水珍珠与海水珍珠氨基酸含量对比分析
氨基酸作为构成蛋白质的基本成分，不同的氨基酸构成直接影响蛋白质的性质，可以反映淡水珍珠及海水珍珠有机成分存在差异。采用Graphpad Prism 8.4.3统计软件分析，组间两两比较采用t检验，以表示；海水珍珠与淡水珍珠氨基酸含量差异较大，对淡水珍珠与海水珍珠两组间14种氨基酸进行统计学分析，除Phe外，海水珍珠中13种氨基酸含量均高于淡水珍珠，具有统计学意义，见表5。且Gly、Asp 2种氨基酸含量较高，含量范围无交集，故选择Gly、Asp 2种氨基酸作为近红外光谱快速检测的关键氨基酸。
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2.8 基于淡水珍珠与海水珍珠含量数据聚类分析
将70批淡水珍珠与38批海水珍珠的含量结果导入SIMCA软件，以14个氨基酸含量（Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg）作为因变量，不同种类（淡水珍珠、海水珍珠）作为自变量，通过正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）（图3）进行聚类分析可以实现淡水珍珠和海水珍珠样品有效区分。本次分析中的自变量拟合指数（R2x）为0.976，因变量拟合指数（R2y）为0.974，模型预测指数（Q2）为0.971，R2和Q2大于0.9表示模型拟合结果合格，经过200次置换检验（Permutation test），如图4所示，Q2回归线与纵轴的相交点小于0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于淡水珍珠和海水珍珠的鉴别分析。
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对上述聚类分析的结果，进行结合变量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）值检验，如图5所示，对于区分淡水珍珠与海水珍珠的14个变量，VIP值大于1表明对区分起到了重要作用，如Gly、Asp、Arg、Tyr、Ala、Leu、His、Ile、Val；VIP值小于1表明该变量对区分起不到作用，如Lys、Glu、Thr、Ser、Phe。结合“2.7”项含量对比分析及VIP图结果，建立Gly、Asp近红外定量模型可用于区分淡水珍珠与海水珍珠。
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2.9 珍珠近红外光谱快速检测模型的建立
2.9.1 珍珠近红外光谱采集取1 g珍珠粉放置于样品指管中。采集方式：漫反射，分辨率：8.0 Hz，扫描次数：32次，扫描范围10 000～4 000 cm?1，温度18～25 ℃。每个样品充分混匀后重复扫描3次。
2.9.2 模型的建立结合珍珠样品差异性成分辨析结果，Asp、Gly 2种氨基酸含量可以作为淡水珍珠及海水珍珠判别的依据，将珍珠Asp、Gly作为2个属性，结合氨基酸实际含量赋值给珍珠光谱图，将赋值后光谱导入NIRcal 5.4数据处理软件，进行数学预建模，样品以K-S方法分类，选取2/3样品作为C-SET，剩余的1/3作为V-SET，采用偏最小二乘法（partial least squares regression，PLS）及主成分分析（principal component analysis，PCA）作为建立模型的方法。
2.9.3 光谱预处理方法的选择近红外光谱可以反映化学官能团信息，但是受样品粒径等物理因素干扰以及光谱的无效信息干扰等，所以需要对光谱进行预处理[20]，常用的预处理算法有一阶导数（1st Derivative，db1）、趋近归一化法（normalization by Closure，ncl）、多元散射校正（multivariate scattering correction full，mf）、标准正态变换（standard normal variate，SNV）、九点卷积平滑一阶导数处理（1st Derivative Savitzky-Golay 9 points，dg1），单位长度标准化（normalization to Unit length，nle）[21-23]，以C-SET建立判别分析数学模型，并用V-SET对模型进行验证，挑选出最优预处理方法以减少无效信息干扰，并以综合评价指标QV作为判断依据，QV值越接近1模型效果越好。未经预处理的图谱分别进行PLS、PCA分析，Asp模型Qv为0.756 8，0.882 8；Gly模型Qv为0.759 1、0.854 9，说明该2种氨基酸本身数据结果较好，但验证集模型回归曲线相关系数较差，因此采用db1，ncl，SNV，mf等多种算法对光谱进一步计算[24]，共进行了60次计算，根据综合评价指标（Q值）选出最优模型[25]，选择结果较好的前12种预处理结果，Asp模型预处理优化结果见表6，Gly模型预处理优化结果见表7，表中标记“*”为最佳建模结果的参数。Asp模型光谱经SNV、db1、ncl以及mf 4种方法预处理后，所建立的定量分析模型和其他的预处理方法相比较Qv值最大，其中经mf预处理后的近红外光谱的校正相关系数最大，验证相关系数最好，同时预处理后的校正集误差与验证集误差较小，且相差不大，说明模型具有较大的稳定性，最终选取预处理方法为mf，波段4 000～10 000 cm?1。Gly模型最佳结果预处理方法为mf、db1、nle，选取4 000～10 000 cm?1波段。珍珠原始图谱经最优模型处理后得到Asp、Gly模型图谱及Asp、Gly模型校正集与验证集回归线性拟合图谱，见图6。
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2.9.4 模型的评价选用最佳的光谱预处理方法和优化后的光谱区间，建立Asp、Gly快速检测模型，随机抽取10批验证集样品进行预测，结果与氨基酸含量测定值比对，以对模型预测能力进行考察分析[26]。
2.9.5 模型预测检验选择优化后模型，以珍珠近红外验证集光谱进行预测，以预测结果对模型进行评价。对比氨基酸分析仪测定值及近红外光谱预测值，Asp模型检测结果的最大相对偏差小于±0.01，相对误差小于±0.1，预测标准偏差（SEV）为0.007 2，对于给定显著水平0.05，t（0.05，9）＝2.26，所得成对t检验值为0.98小于2.26，说明2种方法的分析结果没有显著性差异。Gly模型检测结果的最大相对偏差小于±0.08，相对误差小于±0.1，SEV为0.025 4，对于给定显著水平0.05，t（0.05，9）＝2.26，所得成对t检验值为1.58小于2.26，说明2种方法的分析结果没有显著性差异，即近红外模型通过验证[27-28]。
2.9.6 近红外光谱与氨基酸分析仪检测氨基酸含量对比分析模型预测结果与氨基酸分析仪测定结果对比，经t检验，说明2种方法无显著性差异。对比氨基酸分析仪测定值及近红外光谱预测值，结果见图7，Asp与Gly含量在实际测定中样品含量范围无交集，考察近红外光谱模型效果后，对模型所有样品Asp，Gly预测值进行统计，与实际测定含量符合，说明近红外模型预测结果基本与实际结果相符，模型效果良好，预测结果的准确度较高。而且，通过对比氨基酸分析仪测定值及近红外光谱预测值，发现Asp与Gly在实际测定样品中的含量范围无交集。综上，通过近红外Asp、Gly定量模型可以推断珍珠种类，区分淡水珍珠与海水珍珠。近红外光谱法无需样品前处理，可以减少误差的来源，实现珍珠粉的快速含量测定，降低检测成本，本实验为快速评价珍珠中的氨基酸成分、区分淡水珍珠和海水珍珠提供了可行的方法[29]。
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3 讨论
珍珠作为我国传统中药材，在提高人体免疫力、延缓衰老、祛斑美白、补充钙质等方面都具有独特的作用，壳角蛋白作为珍珠重要的有机成分构成，其主要成分为多种氨基酸，氨基酸含量的不同可以决定蛋白质特性的不同。珍珠在我国具有多基原多产地的特点，不同基原化学成分差异也会影响药材的药效，有效区分淡水珍珠及海水珍珠之间的差异是珍珠质量评价的关键环节，应用新技术结合传统检测方法，明确淡水珍珠及海水珍珠之间的差异，能更好的发挥珍珠药材的药效价值。
本研究收集了不同产地的淡水珍珠及海水珍珠样品108批，对淡水珍珠与海水珍珠的氨基酸进行含量测定，发现两者所含氨基酸种类差异不大，但除Phe外，其余13种氨基酸在海水珍珠中的含量均高于淡水珍珠，具有统计学意义，其中Asp、Gly含量较高，并且二者在淡水珍珠和海水珍珠中的含量范围无交集。此外，对淡水珍珠与海水珍珠含量数据进行聚类分析，发现7种氨基酸VIP值大于1，其中仅Gly、Asp VIP值超过1.2。综上，认为Gly、Asp可在珍珠鉴别上起重要作用，可以将Asp、Gly作为淡水珍珠与海水珍珠鉴别的关键氨基酸。
基于淡水珍珠和海水珍珠中Asp、Gly含量差异特点，本研究建立了近红外光谱技术快速检测模型，在4 000～10 000 cm?1光谱范围内，近红外Asp、Gly含量检测模型的建立与近红外光谱图可以识别氨基酸分子的主要基团O-H、N-H、C-H等吸收峰有关[30]。经实验结果验证，近红外Asp、Gly含量检测模型是可行的，其结果与氨基酸分析仪检测结果一致，对于珍珠快速鉴别在实际应用中具有一定的指导意义。对于中药而言，单一种类的成分评价珍珠是不足的，应建立更加完善科学的质量评价体系，实验同时也提示两者差异性成分与二者药效的相关性需要进一步的研究，进而对两者做出更加全面的评价。本实验在明确药材基原的前提下开展对淡水珍珠与海水珍珠的氨基酸成分的对比研究，利用色谱指纹图谱技术、近红外光谱技术实现了淡水珍珠与海水珍珠的快速检测和区分，为珍珠的鉴别提供了科学的方法及依据。

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