信号传导

p 　　中科院上海药物研究所徐华强研究员领衔的国际交叉团队经过联合攻关，成功解析了磷酸化视紫红质(Rhodopsin)与阻遏蛋白(Arrestin)复合物的晶体结构，并破解了负责关闭GPCR传导信号的磷酸化密码。7月27日，相关研究成果以封面文章发表于《细胞》杂志。 /p p 　　生命的功能是依靠信号传导密码来体现或来执行的。G蛋白偶联受体(GPCR)是人体内最大的细胞膜表面受体家族，通过G蛋白和阻遏蛋白这两条主要信号通路，承担着细胞信号转导的“信号兵”的职责。当受到外界信号刺激，GPCR激活G蛋白发出“开放”信号。而“关闭”信号的则来自于磷酸化密码——GPCR尾部一旦被磷酸化，随即将激活阻遏蛋白并与之形成紧密结合为复合物，从而关闭传导信号。因此鉴定与解释GPCR磷酸化密码是当今细胞信号传导领域的重要科学问题。 /p p 　　据悉，徐华强领衔的交叉团队在2015年成功解析GPCR与阻遏蛋白复合物的完整复合体结构的基础上，对于该结构的尾部高分辨率结构与磷酸化机制展开攻关。 /p p 　　“我们利用世界上最强X射线激光，看清楚了复合晶体的尾部结构信息，并从中解析了其尾部磷酸化招募并与阻遏蛋白结合的过程。”徐华强将研究过程比喻为生命密码的层层解密，“为了验证磷酸化密码的普适性，我们试验了96%的GPCR蛋白，发现70%-80%GPCR的“关闭”信号都由磷酸化密码控制。”最后通过一系列验证生物学功能验证，GPCR招募阻遏蛋白的磷酸化密码就此破解——GPCR通过其尾部氨基酸的磷酸化招募并与阻遏蛋白结合，同时发现该密码对整个GPCR蛋白组具有普遍性。 /p p 　　据了解，结构生物学的重大突破往往与同步辐射光源+X射线自由电子激光的组合密切相关。目前全球已有6个这样的组合，分别位于德国、美国、日本、韩国、瑞士和意大利。 “我们非常期待我国自有的重大科技基础设施，如正在建设与推进中的软X射线与硬X射线自由电子激光装置。”徐华强表示，“这些大科学平台能够为科学家提供更先进、丰富的综合实验手段。” /p p 　　据介绍，这项研究获得国家“重大新药创制”重大专项、973、先导专项以及国际项目等基金的资助。合作研究机构包括加拿大多伦多大学、斯克利普斯研究所、德国Desy自由电子激光科学中心、德国汉堡超快成像中心、加州大学洛杉矶分校、南加州大学、上海科技大学和范德堡大学等。 /p

高分辨氢氘交换质谱技术解析天然免疫受体构象变化与信号传导机制 MDA5是细胞内的异体RNA监测蛋白，属于RIG-I样受体家族（RLRs）的重要成员。MDA5参与多种RNA病毒引起的免疫反应，是天然免疫的一道重要屏障。RLRs家族共有RIG-I、MDA5及LGP2三个成员，其中RIG-I和MDA5的N端均拥有串联CARDs结构域，可通过CARD-CARD同型相互作用招募MAVS，最终促进I型干扰素（IFN）通路的激活。在RLRs抗病毒信号的激活过程中，K63连接的多聚泛素链（K63-polyUb）起着关键作用[1]。前期研究发现，短链K63-polyUb可以通过共价锚定和非共价锚定两种方式有效地促使RIG-ICARDs的寡聚[2, 3]。形成的异源四聚体复合物（K63-polyUb-RIG-ICARDs）可激活MAVSCARD寡聚，形成MAVS纤维的核心[2, 3]。然而，K63-polyUb是如何调控MDA5 CARDs组装以及招募、激活MAVS CARD的分子机制，仍是待解决的科学问题。 Immunity近期中国科学院上海药物研究所郑杰团队在Immunity杂志上以Research Article形式在线发表了题为“Ordered assembly of the cytosolic RNA-sensing MDA5-MAVS signaling complex via binding to unanchored K63-linked poly-ubiquitin chains”的研究成果，本研究通过生物大分子氢氘交换质谱技术（HDX-MS）以及冷冻电镜技术（Cryo-EM）揭示了长链，非锚定K63-polyUb促进MDA5-MAVS组装程序与信号传递的分子机制。MDA5-MAVS首先研究人员建立了K63-，K48-连接泛素链的生化合成平台，并制备了不同长度的K63-polyUbn（2≤n≤14）（图1）。通过基于Orbitrap Fusion平台的氢氘交换质谱技术（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry，HDX-MS），研究人员发现MDA5CARDs和RIG-ICARDs的氢氘交换保护程度依赖于不同长度的K63-polyUbn（MDA5: n≥8 RIG-I: n≥3）而不依赖于K48-polyUbn（n≥10）；并且保护强度随着K63-polyUb的长度增加而特异性加强。 图1：HDX-MS分析K63-polyUb（2≤n≤14）对RLR CARDs寡聚的影响（点击查看大图） 为了研究K63-polyUbn介导的MDA5CARDs寡聚体的组装机制，研究人员利用冷冻电镜首次解析得到了分辨率为3.3Å的MDA5CARDs与K63-polyUb13复合体的结构。这也是MDA5CARDs第一个近原子分辨率的冷冻电镜结构。 那么MDA5CARDs-K63-polyUbn异源四聚体又是如何招募其下游信号蛋白MAVS？研究人员进一步通过Cryo-EM解析得到了分辨率为3.2Å的由长链K63-polyUb11拴系的“自下而上”的左手螺旋MDA5CARDs-MAVSCARD复合体结构。 同时研究人员通过生物大分子氢氘交换质谱技术，首次证明了人类MDA5全长蛋白的CARDs在初始状态下处于张开的构象并可与长链K63-polyUb10结合。然而在早期研究中，氢氘交换质谱已经证明了RIG-ICARDs在初始状态下呈闭合的构象[4, 5]。这也直接证明了RIG-I和MDA5的CARDs在溶液状态下构象上的巨大差异。其次，研究人员进一步发现K63-polyUb10拴系的MDA5CARDs复合物在溶液中的稳定性受MDA5的RNA依赖的ATP酶活性别构调节。图2：HDX-MS分析全长MDA5在其识别配体或底物作用下（dsRNA/ATP/K63-polyUb）的动态的构象变化与信号传导机制（点击查看大图）综上所述该研究通过生物大分子氢氘交换质谱和冷冻电镜技术发现长链，非锚定K63-polyUb类似于一个“分子桥梁”，促进了MDA5CARDs四聚体的组装，使之形成一个激动状态的构象来招募下游MAVSCARD，以进一步促进MAVSCARD的寡聚和激活（图2）。激活状态下的MDA5可以结合并水解ATP，远程提升CARDs-K63-polyUb10的稳定性以持续激活MAVS。该研究弥补了MDA5通路激活与信号传导研究的空白，进一步揭示了长链，非锚定K63-polyUb在细胞内作为内源性激动剂的免疫学功能，为理解泛素分子多样性在抗RNA病毒天然免疫信号传导与调控中的作用提供了新的线索。* 上海药物所博士后宋斌和美国NIH Research Associate陈运为论文第一作者，上海药物所郑杰研究员为论文的通讯作者。该工作得到了新加坡南洋理工大学罗大海教授、吴彬教授，美国Scripps研究所Patrick Griffin教授，上海药物所罗成研究员和张乃霞研究员的大力支持，得到了国家自然科学基金、上海市浦江人才计划等项目的支持。 专家访谈郑杰（中国科学院上海药物研究所 研究员）Q根据您的经验对氢氘交换质谱技术的理解？以及这篇文章的主要的难点在哪里？答：我觉得HDX-MS是基于生物化学这个学科，围绕表征酶活反应机理的一个很实用的技术，HDX-MS第一个应用是来自美国工业界，可以很好地应用于药物发现。这个新工作的一个难点就是采用生化合成了不同长度的K63多聚泛素链，并对RLR CARDs进行了后续功能筛选和表征。如果无法系统合成K63-polyubn（n＞8），我们也无法解决这个科学问题。Q基于高分辨质谱技术的HDX-MS技术作为捕捉蛋白质溶液构象变化的重要研究工具，相对于冷冻电镜技术提供哪些不可或缺的生物学信息？答：HDX-MS和cryoEM提供的信息非常互补，首先，两者联用可以提供高分辨的结构和溶液中动态构象变化的信息。其次，在我们这个研究中，我们使用了HDX-MS去表征MDA5全长蛋白的一系列的构象变化，这对cryoEM研究是很有难度的，因为全长MDA5 的CARDs和Helicase之间的linker长度达到了120个氨基酸且在溶液中是非常活跃的，我们这次利用了HDX分析了MDA5与RNA，ATP互作如何远程调控CARDs与K63-polyub的构象变化。表征好这一系列的构象变化就是表征MDA5在溶液状态下是如果进行信号传导的机制。QHDX-MS技术目前有哪些应用方向，未来应用前景如何？答：HDX-MS捕捉的是溶液状态下蛋白质稳态的信息，研究蛋白质动力学，这对药物发现（drug discovery）研究非常关键，可以大大加速药物的发现与研发。HDX-MS可以直接提供药物与小分子互作，以及生物大分子抗体药物识别抗原等研究提供接近生理意义的重要信息。我博士后是在美国Scripps研究所Patrick Griffin教授进行的训练，当时实验室的同事很多都去了美国大药企利用HDX-MS参与药物发现。其中Mike还在礼来公司搭建了一套高通量全自动的HDX设备，专门为礼来的小分子药物发现筛选而设定。回国后我们也正朝着这个方向努力，实现HDX-MS软件和硬件的进一步自动化，希望未来在国内可以实现HDX-MS高通量。另一个努力的方向是早日实现单氨基酸残基分辨率的HDX-MS技术的升级，这可以 帮助精准表征药物作用关键氨基酸残基。为了实现这个目标，HDX-MS的自动化进样平台机械臂模块需要一定的改造，比如更严格的控温，更高频率的连续进样来优化质谱的采集效率。最终我希望可以利用高通量HDX-MS平台去建一个蛋白库，提供氢键，自由能，单氨基酸残基HDX等可以量化的参数，更精准的帮助科研工作者了解蛋白质的折叠，去折叠等稳态的信息。 关于作者中国科学院上海药物研究所郑杰实验室长期结合生物大分子氢氘交换质谱技术交叉解决由蛋白质（酶）的动力学异常变化所导致的重大疾病的发生机制，聚焦RNA天然免疫模式识别受体的内源，外源性配体识别与信号传导机制，以及自身免疫疾病发生机制。围绕氢氘交换及其应用，以第一作者或通讯作者在Immunity 2021，Anal Chem 2019，Nat Commun 2018，structure 2018， Nat Commun 2017，Nucleic Acids Res 2015等期刊上。感谢郑杰老师对本文的指导与支持参考文献：1. Hu, H. and S.C. Sun, Ubiquitin signaling in immune responses. Cell Res, 2016. 26(4): p. 457-83.2. Zeng, W., et al., Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell, 2010. 141(2): p. 315-30.3. Peisley, A., et al., Structural basis for ubiquitin-mediated antiviral signal activation by RIG-I. Nature, 2014. 509(7498): p. 110-4.4. Zheng, J., et al., High-resolution HDX-MS reveals distinct mechanisms of RNA recognition and activation by RIG-I and MDA5. Nucleic Acids Res, 2015. 43(2): p. 1216-30.5. Zheng, J., et al., HDX-MS reveals dysregulated checkpoints that compromise discrimination against self RNA during RIG-I mediated autoimmunity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5366.扫描下方二维码即可获取赛默飞全行业解决方案，或关注“赛默飞色谱与质谱中国”公众号，了解更多资讯+

安捷伦公司大力支持第三届信号传导、炎症与癌症上海国际研讨会 （Shanghai Symposium: Signaling, Inflammation and Cancer） 　　癌症严重威胁着人类的健康和生命，人们至今仍未真正全面了解癌症的致病机制。近年的研究表明，细胞信号转导与肿瘤的发生、发展和复发、转移密切相关。 　　　　　　　　　　　 　　2011年7月25-28日，信号传导、炎症与癌症上海国际研讨会在中科院上海生化细胞所隆重召开，本次会议主题为：信号转导及癌症。会议讨论的议题包括：1.癌症与干细胞 2.炎症与癌症的关系 3.表观遗传学和癌症的关系 4.癌症的转化医学；5.肿瘤免疫的研究。约200位国内外该领域的顶级专家学者相聚一堂，进行了深入交流。 　　作为生命科学领域的领先行业解决方案供应商，从人类健康、疾病和衰老等基本问题出发，安捷伦公司对于本届会议给予了密切关注与大力支持，以共同推动国内相关领域的研究。对于蛋白质组学分析，安捷伦公司可唯一提供从样品前处理到仪器分析、数据处理到系统生物学解释的一体化解决方案；因同时具备ChipLC，高端QTOF和QQQ及相应软件手段，安捷伦公司可提供生物标识物从定性发现到定量确认的完整方案（下图）；此外，安捷伦Mass Profiler Professional为目前业内唯一可全面整合基因组、蛋白质组及代谢组学数据，以及LC/MS，GC/MS，CE/MS平台数据的生物信息学软件，可进行路径分析、翻转评价或基因和生物体功能显型的相关性评价，协助用户真正实现系统生物学领域的研究与突破。 　　　　 　　安捷伦可提供蛋白质组/代谢组学中生物标识物从定性发现到定量确认的完整解决方案 　　 　　对于代谢组学分析，安捷伦科技可提供业内代谢物组学研究最完备的分析平台&mdash 包括GC、LC、CE、GC/MS、GC/MS/MS、GC/QTOF、LC/QQQ、LC/QTOF、CE/MS及NMR等，同时可提供强大的数据处理及软件工具包用于代谢物鉴定、定量和统计分析。代谢组学样品组分种类繁多，数量庞大，基质复杂，鉴别难度大，针对这一情况，安捷伦公司适时推出了用于LC/(Q)TOF的METLIN数据库，以及用于GC/MS的保留时间锁定代谢物谱库Agilent Fiehn Metabolomics Retention Time Locked Library，该库为第一个代谢组学研究的代谢物标准商业数据库，包括内源性代谢物鉴定。METLIN个性化代谢物数据库是目前最全面的代谢物数据库，包含23 000 多种内源性和外源性代谢物，以及二肽和三肽，用户还可自行补充个性化化合物库，以便更方便快捷地进行检索，代谢物二级谱库的建立及检索功能进一步确保了分析鉴定的准确性和可靠性。METLIN和Fiehn数据库大大方便了用户代谢组学研究工作，并显著提高其研究效率。安捷伦公司可提供代谢组学中生物标识物从发现到确认的完整解决方案。 　　 　　7月27日晚举行的大会闭幕晚宴上，安捷伦公司大中华区生命科学市场经理庄晨杰先生代表安捷伦公司进行了晚宴致辞。 　　 　　安捷伦公司将一如既往地携手广大生命科学领域用户，共同推进祖国生命科学事业的振兴，为全人类的健康事业共同努力！ 　　 　　更多安捷伦系统生物学信息，请访问：http://www.chem.agilent.com/en-US/solutions/integratedbiology/pages/default.aspx 　　 　　订阅Access Agilent电子刊物，请登录: www.agilent.com/chem/accessagilent:cn 关于安捷伦科技 　　安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是全球领先的测量公司，同时也是通信、电子、生命科学和化学分析领域的技术领导者。公司的18500 名员工为100 多个国家的客户提供服务。在2010 财政年度，安捷伦的业务净收入为54 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn。