基因筛选

荷兰格罗宁根大学的研究人员利用基因挖掘法从蓝色链霉菌中发现了一组活性基因簇，通过该基因簇可制造出无耐药性的新型抗生素，该研究有望为链霉菌的药用开发提供一条新思路。相关研究发表在最新一期《微生物学》（Microbiology）杂志上。 链霉菌是生活在土壤中的一种常见细菌，其家族包含多种细菌。不同于其他细菌，链霉菌在生长中会形成或长或短的孢子丝，为了生存，在繁殖前链霉菌会产生大量的天然抗生素以抵御竞争者。利用这一特性科学家已制造出了包括链霉素、四环素和红霉素在内的多种抗生素。与此同时，为保护自身免受这些高浓度致命代谢物的伤害，链霉菌同时也积累了相应的抗生素耐药基因和调节基因，而这些基因也被认为是病原细菌获得性耐药因子的最初来源。2002年英国科学家完成了对蓝色链霉菌的基因测序工作，发现这种链霉菌拥有800多万个碱基对和7825个可疑基因，是迄今为止拥有最多基因的细菌。当年5月9日发表在英国《自然》杂志上的文章，还专门描绘了3种当时未知的抗生素装配蓝图，并称这3种抗生素一旦被识别，就可作为药物开发中的启动化合物加以使用。新研究中，格罗宁根大学的研究人员通过基因挖掘的方法成功识别出了蓝色链霉菌中一组被称为cpk的基因簇，并可通过实验手段自如控制其活性。实验显示，由该基因产生的新型抗菌化合物可对包括大肠杆菌在内的多种细菌产生抗菌效果。负责该研究的格罗宁根大学佐藤高野教授称，细菌性传染病感染早期一般都较为温和且容易治愈，而一旦恶化就极易致命且具有极强的耐药性，现存的大多数药物对其都无显著疗效。因此，必须尽快开发出能对抗此类疾病的新型抗生素。利用基因挖掘法他们首次在蓝色链霉菌中识别出了有效的基因簇，此外，该法也可同样用于对其他丝状真菌以及微生物的基因筛选。未来，随着科学家们对链霉菌次级代谢分子调控机制研究的进一步深入，链霉菌将成为一个极为丰富的医药宝库。（生物谷Bioon.com）

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其 它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎 叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)　nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作 用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰 转移酶基因测时可通过放射自显影观察。荧光素酶基因（luciferase Gene）1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片 或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。β-D-葡萄糖苷酶基因该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、荧光等进行检测。除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长 紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。

第一步：目的基因的制取: 用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切，产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法. 第二步：基因载体的选取: 用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。 基因克隆载体必须具备三个条件： a.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。 b.能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。 c.必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/bz1.jpg基因工程的基本过程(点击放大) 第三步：DNA的体外重组: 即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。 第四步：DNA重组体导入受体细胞: 将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体，即重组DNA。 这种重组体连接的方法主要有： 粘性末端连接法：应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子，可产生相同的粘性末端（接口处的碱基互补），进一步用DNA连接酶将断口连好，即可获得重组DNA分子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/zhuru.jpgDNA重组体导入受体细胞 钝性末端连接法：用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段，均为钝性末端，这种末端也可以用特殊的连接酶连接，但效率太低。通常需要用人工方法加上粘性末端，再进行连接。第五步：受体细胞的繁殖扩增: 含重组DNA的活受体细胞，再在适当的培养条件下，并进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。 第六步：克隆子的筛选和鉴定: 受体细胞经转化（传染）或传导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，需要对克隆子进行筛选和鉴定。 第七步：目的基因的表达。