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下载地址:http://www.instrument.com.cn/download/shtml/036497.shtml本书由数十位中青年医学分子生物学专家集体编著。详细系统的介绍了基因和基因工程概论、基因组的结构、基因的转移和重组、基因表达的调控、工具酶及其应用、基因工程载体及其选用、聚合酶链反应、基因的克隆及其进展、外源基因表达系统、转基因动物、基因诊断、基因工程抗体、基因工程药物、基因治疗及基因工程疫苗等,还收录了数10种常用的分子生物学试验方法。具有简明扼要、图文并茂、可操作性强等特点。希望大家尊重原创,并在引用时,注明出处。
第一步:目的基因的制取: 用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切,产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因,是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段,能编码某一产物或某一性状。目前获取目的基因的方法主要有三种:反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法. 第二步:基因载体的选取: 用人工方法,取得目的基因的适宜的载体,即质粒(一种环状双链DNA)或病毒。载体一般带有必要的标志基因,以便进行检测。 基因克隆载体必须具备三个条件: a.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。 b.能携带外源DNA进入受体细胞,或游离在细胞质中进行自我复制,或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。 c.必须具有选择标记,承载外源DNA的载体进入受体细胞后,以便筛选克隆子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/bz1.jpg基因工程的基本过程(点击放大) 第三步:DNA的体外重组: 即用人工方法,让目的基因与运载体相结合,首先要用限制性内切酶和其他一些酶类,切割或修饰载体DNA和目的基因,然后用连接酶将两者连接起来,使目的基因插入载体内,形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行,所以基因工程操作又叫体外DNA重组。 第四步:DNA重组体导入受体细胞: 将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体,即重组DNA。 这种重组体连接的方法主要有: 粘性末端连接法:应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子,可产生相同的粘性末端(接口处的碱基互补),进一步用DNA连接酶将断口连好,即可获得重组DNA分子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/zhuru.jpgDNA重组体导入受体细胞 钝性末端连接法:用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段,均为钝性末端,这种末端也可以用特殊的连接酶连接,但效率太低。通常需要用人工方法加上粘性末端,再进行连接。第五步:受体细胞的繁殖扩增: 含重组DNA的活受体细胞,再在适当的培养条件下,并进行繁殖和扩增,使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。 第六步:克隆子的筛选和鉴定: 受体细胞经转化(传染)或传导处理后,真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分,而绝大部分仍是原来的受体细胞,或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子,需要对克隆子进行筛选和鉴定。 第七步:目的基因的表达。
摘要 文章主要介绍以基因工程构建菌种E. coli (pTH08+prh-T04)/VT418发酵生产L-苏氨酸,在10M3发酵罐中发酵产酸8.5-9.0%;转化率39-41%;周期48-52小时。文章强调在苏氨酸发酵过程中pH值以及溶氧的控制非常重要关键词:基因工程、发酵、苏氨酸一、前言L-苏氨酸是一种必需氨基酸,按世界粮农组织的标准计算,一克食品蛋白质中含苏氨酸40mg,占全部氨基酸的11%。欧美型食品中缺少苏氨酸,补充苏氨酸就能提高食品的营养价值。配合饲料也需要苏氨酸,因此近十年来,苏氨酸生产增长了5.3倍。具统计,1990年全世界苏氨酸产量为700吨/年,1996年增加到4000吨/年,2002年则猛增至35000吨。资料显示,使用植物型饲料,成畜必需添加赖氨酸和苏氨酸,比例为10:1,而幼畜为3:1。按10:1计算,目前全世界苏氨酸的需求量不应低于5万吨/年,缺口为较大。苏氨酸的生物合成途径及代谢调控机理来看,苏氨酸和赖氨酸一样,同属天冬氨酸族氨基酸。是葡萄糖经糖酵解途径生成丙酮酸,再经三羧酸循环CO2固定反应生成四碳二羧酸,后经氨基化反应生成天冬氨酸。国内外通常用传统育种和基因工程方法来获得苏氨酸的高产菌种,传统育种目前最高产酸为2-3%。在基因工程菌方面,木柱等将解除AKⅠ和HDⅡ反馈抑制的突变株HNr59的Etr-1基因导入产苏氨酸25g/L的T-693菌株,选育出具有6种调节变异组合的转导子T-1026,相同条件下可产苏氨酸40g/L。据日本味之素公司报道,用E.coliK12菌株(AHVr+Ile-+Met-+pro-)含苏氨酸合成酶操纵子基因的质粒转化E.coliK12(Thr-),积累苏氨酸13.4g/L(转化率40%),小罐发酵产酸65g/L,转化率48%。前苏联全苏工业微生物遗传育种研究所的Debabov等构建了大肠杆菌基因工程菌E.coli BKIIMB-3996 工程菌,重组质粒Pvic40中含苏氨酸操纵子的三个基因thr A, thrB, thrC,遗传标记为Sac+(能以蔗糖为碳源), thr r (抗苏氨酸)和Hser(抗高丝氨酸),在蔗糖为碳源的流加补料方式,最高产量为85.0 g/L。综上所述,国内外用传统育种方法的菌种产酸水平在30-40g/L;用基因工程方法的菌种产酸水平在80-90g/L。二、材料与方法1. 菌种:E. coli (pTH08+prh-T04)/VT418 (上海新立公司构建)2. 培养基配方2.1 斜面培养基(g/l)葡萄糖 2.0 NH4Cl 1.0 KH2PO4 1.5 Na2HPO4 3.5 MgSO4·7H2O 0.1琼脂 20.0 加蒸馏水溶解,调pH7.0-7.2,定容1000ml,0.8Kg/cm2灭均30分钟,冷却至50℃左右加入氨苄青霉素溶液,最终浓度为50γ/ml。2.2 摇瓶种子培养基(g/l)葡萄糖 40.0 KH2PO4 1.0 MgSO4·7H2O 0.5 (NH4)2SO4 10.0 玉米浆2.0 CaCO3 15 氨苄青霉素 50γ/ml 加自来水溶解,调pH7.0-7.2,定容1000ml,分装至500ml摇瓶,0.8Kg/cm2 灭菌30分钟,接种前加入CaCO3(121℃,60分钟灭菌,烘干)和氨苄青霉素。2.3摇瓶发酵培养基(g/l)葡萄糖 80.0 (NH4)2SO4 25.0 KH2PO4 2.0 MgSO4·7H2O 1.0MnSO4·5H2O 0.5 FeSO4·7H2O 0.5 CaCO3 30.0 加自来水溶解,调pH7.0-7.2,定容1000ml,分装至500ml摇瓶,0.8Kg/cm2 灭菌30分钟,接种前加入CaCO3(121℃,60分钟灭菌,烘干)2.4 种子罐培养基葡萄糖4% (NH4)2SO4 1% KH2PO4 0.1% MgSO4·7H2O 0.05% 玉米浆 0.2% 泡敌0.01%。加水溶解pH自然,121℃灭菌20分钟,消后定容400L。接种前加入无菌氨苄青霉素50ug/L。2.5 发酵罐培养基葡萄糖8% (NH4)2SO4 2.5% KH2PO4 0.2% MgSO4·7H2O 0.1%FeSO4·5H2O 0.05% MnSO4·5H2O 0.05% 泡敌 0.01%。加自来水溶解pH自然,121℃灭菌20分钟,消后定容5.1M3。1.0Kg/cm2灭菌20分钟。