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【讨论】乳制品中抗生素残留现状及其检测方法探究

  • 老多_小多
    2009/02/10
  • 私聊

乳制品检测

  • 来源:中国论文下载中心 作者:冯建成 张容鹄

    乳及乳制品是老少皆宜的营养品,在我国,乳制品及乳制品工业发展迅速,同时畜牧业也发展迅猛,β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类等抗生素在乳畜饲养业中广泛应用,造成乳及乳制品中抗生素残留,给消费者健康带来了潜在威胁,因而提高抗生素残留的检测技术显得尤其重要,尽快开发或引进先进的抗生素检测技术以解决我国当前乳和乳制品行业面临的难题已成为当务之急。
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      1 抗生素残留现状
      
      我国乳制品中抗生素的残留现状不容乐观,2006年的一份对北京、天津、石家庄5个零售点的77个牛奶样品进行β-内酰胺酶的残留检测,63.6%的样品检测为阳性。一项对我国几个大城市如西宁、南宁、广州、杭州、泉州、北京等城市乳制品质量的检测调查结果显示,在近八百份乳品采样中,抗生素残留超标居不合格项目第一位。
      
      2 抗生素残留的来源及其危害
      
      乳和乳制品中抗生素残留的来源要追寻到原料生产及其流通过程。首先,使用抗生素防治动物疫病。对患病奶牛用药不当及不遵守停药期是造成牛奶中抗生素残留的重要因素。其次,抗生素类饲料添加剂的使用。第三,饲养户和经营商为了保鲜,将抗生素人为添加到畜产品中,来抑制微生物的生长、繁殖,防止牛奶酸败变质 ,也是造成抗生素残留超标的重要因素。
      从乳制品加工的角度来看,原料乳中抗生素残留物严重干扰发酵乳制品的生产,抗生素残留可严重影响干酪、黄油、发酵乳的起酵和后期风味的形成。长期服用含低剂量抗生素残留的乳制品,日积月累会危害人体健康。主要危害表现在:其一,毒性作用,如长期摄入氨基糖苷类抗生素严重超标的乳产品可导致肾毒性和耳毒性。其二,过敏反应。其三,病原菌耐药性增加。其四,破坏人体胃肠道微生物菌群的动态平衡。其五,妨碍我国畜产品的国际贸易。
      
      3 抗生素残留检测方法的研究进展
      
      目前抗生素残留检测的方法很多,基本上可以分为四大类型:一是经典的微生物检测方法;二是现代仪器分析方法;三是生化免疫分析法;四是专一试剂盒法。
      3.1 经典微生物检测法
      其测定原理基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作检测用,因而与临床应用的要求一致,但其测定时间长且结果误差较大。如TTC法、戴尔沃检测(Delvotest SP)法、BY法等。
      3.1.1 TTC法 
      TTC法是国际上较早通用的标准测定法,也是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准(GB4689.27-94)规定的检测法。如果牛奶中含有抗生素,则加入菌种(嗜热链球菌)经培育2.5-3h后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色。TTC法检测的各种抗生素灵敏度如下:青霉素为0.004单位、链霉素0.5单位、庆大霉素0.4单位、卡那霉素5单位。TTC法主要对于青霉素类和氯霉素药物敏感,但对链霉素不太敏感,对新霉素根本不敏感,并且消毒剂可干扰TTC试验。TTC法检测抗生素残留虽然费用较低,但检测方法消耗时间也相对较长,因此应用受到一定限制。
      3.1.2 戴尔沃检测(Delvotest SP)法
      是由荷兰其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物——嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5~3h后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色。可检测到β-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类等,其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏。Delvotest SP 法操作方便,严格实用,容易判断,结果可靠,费用适中等优点;但也易出现假阳性,此方法适用于农场、企业、实验室及政府监测部门。
      3.1.3 BY法
      BY法,也称蓝黄检测法,是一种广谱的微生物抑制法,能在较短的时间里检测到乳制品中抗生素的残留,通过颜色的对比判断阳性、阴性和可疑样品。B•Linage等通过这种方法对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类等25种抗生素进行了检测,其残留的检测限与欧盟规定的检测限很接近。此方法耗时短,操从简单,检测抗生素种类较多,但误差较大,容易误检。
      3.2 现代仪器分析方法
      是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或理化特性,借助现代仪器对抗生素残留进行精确分析的一种方法。如色谱法、荧光法、毛细管电泳、色谱质谱联用技术等。
      色谱法有气相色谱(GS)、高效液相色谱(HPLC)法、反相高效液相色谱法等。检测的过程运用了色谱理论,通过高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤,能检测抗生素的具体含量。蔡颖用反相HPLC法测定乳制品中土霉素、四环素和金霉素残留量。检测限为:土霉素为15.0μg/kg、四环素为20.0μg/kg、金霉素为18.0μg/kg。Jian Wang等运用超高效液相色谱和飞行质谱联用(UPLC/Q-Tof MS)和LC/MS/MS测定牛奶中大环内酯类抗生素的残留量,其检测限为:红霉素40ug/kg,泰乐菌素50ug/kg,替米考星50ug/kg,能满足各国对这六种β-内酰胺类抗生素的最低检出要求。
      仪器分析方法分离速度快、效率高和自动化程度高,能检测抗生素的具体含量,敏感性较高,结果准确,但待检样品需经一系列的预处理,繁琐费时,还必须有相应的价格昂贵的仪器设备。一般在大型实验室使用,适合于精确测定。
      3.3 生化免疫法
      目前应用的生化免疫分析技术,是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。其基本原理是抗原抗体的竞争性结合。可分为酶联免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法等。
      酶联免疫吸附测定(ELISA):以待测抗原(或抗体)与酶标抗体(或抗原)的特异结合反应为基础,通过酶活力测定来确定抗原(或抗体)含量。因为结合了免疫反应和酶催化反应,所以是一种特异而又敏感的技术。YONG JIN运用酶联免疫法(ELISA)对庆大霉素的检测限度为0.5 ng/mL。Bucknal等运用免疫检测法测定了在牛奶中几种喹诺酮药物的残留量。酶联免疫法测定,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的β-内酰胺类计:青霉素为5ppb,阿莫西林为10ppb,氨苄西林为10ppb,头孢西林为8ppb。其检测结果快速准确,9分钟内即可检测出牛奶中β-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量,可监控牧场用药的情况。
      荧光免疫测定(FIA)法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮,检测产物发出的荧光,荧光强度与抗原抗体复合物(Mb)浓度呈正比,可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。Huth 已经用荧光免疫法测定了牛奶中的6种β-内酰胺类抗生素,得到它们的最低检测限为:青霉素G3.2μg/kg、氨苄青霉素2.9μg/kg、羟氨苄青霉素3.6μg/kg、头孢匹林16.3μg/kg;该法重复性好,具有快速、敏感、准确的特点。生化免疫法测定抗生素残留灵敏度极高,达到ng级水平;检测快速、专一性强。由于此法的高度专一性,每检测一种抗生素就要制备或购买相应的抗原或抗体,导致检测费用较高。因此生化免疫检测法不可能取代色谱或光谱等常规分析方法,只能作为其重要的补充。
      
      4 专一试剂盒法
      
      ECLIPSE试剂盒的原理是含有芽孢杆菌的琼脂培养基和pH指示剂,当在(65±1)℃下培养时,孢子发育生长,降低培养基pH值,在pH指示剂的作用下,蓝(紫)色变为绿-黄色。生鲜牛乳中的抗生素残留使微生物生长和酸的产生受到抑制,由于没有酸生成,颜色将不会改变。。
      ECLIPSE试剂盒有ECLIPSE50和ECLIPSE100两种试剂盒。ECLIPSE50的精确度虽然没有ECLIPSE100的高,但其检测限都符合欧盟标准,弥补了快速方法只能单一检测某类抗生素的缺陷,同时提高了检测的广谱性和高灵敏度,同时也可以同欧盟等国家的先进检测技术和标准接轨我国的牛奶事业提供非常有效和准确的抗生素残留检测方法。且操作简单,灵活性强,无需对样品进行任何的处理,只需严格按照说明书上规定的方法进行操作,就能获得理想的效果,且不易出现假阳性现象,被检样品的需要量少,且费用低,越来越被广泛应用。
      乳制品抗生素残留的检测方法很多,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响。牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题,开发出越来越准确、快速,误差越来越小的检测方法,方便地检出乳和乳制品中抗生素残留,净化消费环璄,就能为居民的身心健康提供保障,促进中国乳业健康发展。
      
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  • 快乐

    第1楼2009/02/14

    应助达人

    现代仪器法是检测抗生素的主流和方向,希望多多交流

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    +关注 私聊
  • feiyuankj

    第2楼2009/11/12

    【原理】
    牛奶中抗生素总残留检测试剂盒是一种利用微生物生长抑制法快速筛选牛奶中抗菌药残留是否超标的试剂盒。该试剂盒由含有散播芽孢杆菌的琼脂培养基和pH指示剂的微孔板组成。将牛奶加入微孔中,65℃培养,若牛奶中抗菌药的浓度低于试剂盒的检测限(或无抗菌药残留),则芽孢杆菌生长发育,产生酸性物质,降低培养基的pH值,在指示剂的作用下,培养基的颜色由紫色变为黄色或黄绿色。相反,若牛奶中抗生素的浓度高于试剂盒的检测限,芽孢杆菌的生长和酸的产生将受到抑制,培养基的颜色为紫色或浅紫色。
    【适用范围】

    适用于各残留检测监控机构、超市、奶牛场、收奶站、乳制品公司等单位检测牛奶中青霉素类、头孢菌素类、氨基苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类等药物的残留。
    【试剂盒组成】
    可拆卸的微孔板(96孔) 5块/盒
    粘胶薄膜 5张/盒
    使用说明书 1份
    【所需设备】
    移液器、恒温水浴锅(65℃±0.5℃)或其它恒温设备。
    【操作步骤】
    1.将水浴锅或恒温设备的温度设为65℃,打开电源预热。
    2.确定所需微孔数量,用剪刀或刀片沿微孔外沿划开铝箔膜(注意:不要划开剩余的微孔板上的铝箔膜,以防水分挥发或细菌污染)。
    3.取下微孔板条。剩余的微孔板(条)立即放回塑料袋中密封,置于2~8℃储存。
    4.将要使用的微孔板(条)安放至另一板架上,剥开微孔上的铝箔,在每个微孔中加入50µL待检牛奶样品,轻轻混匀。同时选2个微孔加无抗奶作阴性对照。
    5.用胶粘薄膜小心密封微孔板(条),将其置于已经预热至65℃的水浴锅或恒温设备中培养2h40min~3h(注意:必须保证微孔完全密封,防止培养过程中有水滴至微孔中,影响结果判定)。
    6.当阴性对照样品变为黄色时,取出微孔板(条),从微孔侧面观察样品的颜色。
    【结果判断】
    若样品颜色变为黄色或黄绿色,表示该样品为阴性(-),无抗生素残留(或浓度低于试剂盒的检测限)。若样品颜色为浅紫色(+)或紫色(++),表示样品为阳性,有抗生素残留。
    【生产单位】
    武汉飞远科技有限公司生产
    国家兽药残留基准实验室(HZAU)/国家兽药安全评价实验室/农业部食品安全重点开放实验室监制

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  • 天天洗碗

    第3楼2009/12/15

    太多了,就检测残留就有N多项,慢慢捡吧

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  • luolili

    第4楼2009/12/23

    随着检测技术的不断发展,液质、气质将不断应用到抗生素的残留检测中。

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  • 小鸟飞翔

    第5楼2009/12/30

    一般检测中的结果如何?满意不?

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  • zaijian888

    第6楼2009/12/30

    应该建立一套检测体系,先初查,确定有无抗生素,然后再根据情况进行细查,传统检验与现代分析相结合。

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