食品中脱氢乙酸的测定高效液相色谱法的方法验证报告

高秋荣

2018/07/28
国联质检团队

私聊

液相色谱（LC）

食品中脱氢乙酸的测定高效液相色谱法的方法验证报告

GB/T 23377-2009

牛晓

一、方法概述
适用范围：本标准适用于黄油、酱菜、发酵豆制品、面包、糕点、培烤食品馅料、复合调味料、果蔬汁中脱氢乙酸含量的高效液相食品测定方法，其他食品可参照执行。
原理：用氢氧化钠溶液提取式样中的脱氢乙酸，经脱脂、去蛋白处理后，用高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器：
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。仪器编号：UNQD-YQ-096
1.2不锈钢高速均质器。
1.3离心机。
1.4 分析天平:感量0.0001g和感量0.01g。
1.5超声波发生器：功率大于180W
1.6涡旋混合器。
1.7粉碎机。
1.8 C₁₈固相萃取柱：500mg,6mL（使用前用5mL的甲醇、10mL谁活化，使柱子保持湿润状态）。
2. 试剂
2.1甲醇：色谱纯
2.2正己烷。
2.3乙酸铵：优级纯。
2.4甲酸溶液：10%。取10mL甲酸，加90mL水，混匀。
2.5乙酸铵溶液：0.02mol/L。称取1.54g乙酸铵，用水溶解并定人至1L。
2.6氢氧化钠溶液：20g/L.称取20.0g氢氧化钠，用水溶解并定人至1L.
2.7硫酸锌溶液：120g/L。称取120g七水硫酸锌，用水溶解并定人至1L。
2.8甲醇溶液：70%。取70mL甲醇，加30mL水，混匀。
2.9脱氢乙酸标准品来源：上海安谱货号：CDAA-263002
三、样品的制备与保存
取具有代表性的样品粉碎均匀备用。
四、分析步骤
4.1、标准曲线绘制
4.1.1脱氢乙酸标准品：脱氢乙酸含量≥98%
4.1.2标准储备溶液：准确称取10.0mg脱氢乙酸标准品，用10mL20g/L氢氧化钠溶液溶解，用水定容至刻度。配成1000.0μg/mL的标准储备液。
4.1.3标准工作液：准确移取标准储备0.01mL、0.025mL、0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL于10mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，配成成浓度为1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL系列工作液。

4.2样品的处理
4.2.1提取：
4.2.1.1果蔬汁：准确称取2g-5g式样，精确至0.01g,置于50mL容量瓶中，加入约10mL水，用氢氧化钠溶液调pH为7-8，加水稀释至刻度，摇匀，置于离心管中，4000r/minl离心10min，取20mL上清液用10%的甲酸调pH值至4-5，定容到25mL，取5mL过已经活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，用2mL70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱测定。
4.2.1.2酱菜、发酵豆制品：样品用不锈钢高速均质器均质，准确称取2g-5g均匀式样，精确至0.01g,置于25mL容量瓶中国，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH为7-8，加水稀释至刻度，超声提取10min,取适量置于10mL离心管中，4000r/min离心10min,取上清液过0.45μm滤膜，供高效液相色谱测定。
4.2.1.3黄油、面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料：样品用粉碎机磨碎，准确称取2g-5g均匀式样，精确至0.01g，置于25mL容量瓶中，加入约10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH为7-8，加水稀释至刻度，超声提取10min,转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min,静置分层，弃去正己烷层，再加入10mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取上清液过0.45μm滤膜，供高效液相色谱法测定，若高效液相色谱分离效果不理想时，可取20mL上清液，用10%的甲酸调pH至4-6，定容至25mL，取5mL过已经活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，用2mL70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱测定。
4.3.仪器测定条件
4.3.1色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5.0μm。
4.3.2流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵溶液=10+90，体积比
4.3.3流速：1.0mL/min。
4.3.4进样体积：1.0μL
4.3.5柱温：30℃。
4.3.6进样量：10μL。
4.3.7检测波长：293nm。
五、结果处理
计算公式：

式中：
X-样品中脱氢乙酸的含量，单位为g/kg;
C-由标准曲线查得试样中脱氢乙酸的浓度为μg/mL；
C₀-由标准曲线查得空白试样中脱氢乙酸的浓度为μg/mL；
V-试样溶的总体积，单位为mL;
f-过固相萃取柱换算系数（f=0.5）;
m-样品的质量，单位g。
计算结果保留至小数点后3位。
六、验证结果
1.线性结果
将混合标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
同时做空白实验。
Y=4085.54X-4799.78R^2=0.9996307

以上结果表明脱氢乙酸在1.0μg/mL～100.0μg/mL范围内，R^{^2}=0.9996307，脱氢乙酸浓度和峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将5.0μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=9.50，得出脱氢乙酸的定量检出限为2.5mg/kg，此检出限结果小于国标GB/T 23377-2009的定量检出限5.0mg/kg，故此方法满足条件。
七、方法精密度（重复性）
对LBF180700281样品分别进行6次加标重复性的测定，测定结果如下：

测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	5.0207	5.0300	5.0808	5.0251	5.0036	5.0087
浓度（μg/mL）	25.428	24.875	25.920	25.525	25.558	25.351
含量（mg/kg）	0.127	0.124	0.128	0.127	0.128	0.127
平均值（mg/kg）	0.127
RSD%	1.17

本方法的精密度为1.17%，符合GB/T 23377-2009中给出试样测试结果的精密度要求，因此，本次测定均符合要求。
八、准确度验证（加标回收）
对LBF180700281样品加标，取1000.0 μg/mL的标液0.5mL、0.625 mL、0.8mL同样品同步处理后，结果见下表：

测定编号		脱氢乙酸
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	脱氢乙酸含量（g/kg）	平均值（g/kg）	加标量（g/kg）	回收率%
1#	5.0304	25.0	ND	ND	ND	/	/
2#	5.0028	25.0	ND	ND	ND	/	/
加标1#	5.0255	25.0	17.581	0.087	0.087	0.099	87.9
加标2#	5.0085	25.0	21.982	0.110	0.110	0.125	88.0
加标3#	5.0068	25.0	32.028	0.160	0.160	0.175	91.4