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食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠检测方法验证报告

高秋荣

2018/07/28
国联质检团队

私聊

液相色谱（LC）

食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠检测方法验证报告

GB 5009.28-2016（第一法）

李晓东

一、方法概述
1 范围
本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法。
本标准适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。
2 原理
样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器
1.2分析天平：感量0.0001g和0.001g
1.3匀浆机
1.4恒温水浴锅
1.5涡旋混合器
1.6高速离心机：转速不低于8000r/min。
1.7超声波发生器
2. 试剂
除非另有说明，本方法所有实际均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1甲醇：色谱纯。
2.2乙酸铵: 色谱纯。
2.3甲酸：色谱级
2.4氨水
2.5亚铁氰化钾
2.6无水乙醇
2.7正己烷
2.8氨水溶液：取1ml氨水加到99ml水中，混匀后备用。
2.9亚铁氰化钾溶液（92g/L）：称取106g亚铁氰化钾，加适量水溶解，用水定容至1L。
2.9乙酸锌溶液（183g/L）：称取220g乙酸锌溶于少量水中，加入30ml冰乙酸，用水定容至1L。
2.10乙酸铵溶液（20mmol/L）：称取1.54g乙酸铵，加入适量水溶解后用水定容至1L,经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用。
2.11甲酸-乙酸铵溶液（2mmol/L甲酸+20mmol/L乙酸铵）：称取1.54g乙酸铵，加入适量水溶解，再加入75.2μl甲酸，用水定容至1L，经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用。
3. 材料
3.1水相微孔滤膜
3.2塑料离心管
二、样品的制备与保存
取多个预包装的饮料、液态奶等均匀样品直接混合；非均匀的液态、半固态样品用组织匀浆机匀浆；固体样品用研磨机充分粉碎并搅拌均匀；奶酪、黄油、巧克力等采用50℃~60℃加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。取其中200g装入玻璃容器中，密封，液体试样于4℃保存，其他试样于-18℃保存。
三、分析步骤
3.1、标准曲线绘制
3.1.1苯甲酸：纯度≥99.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.1.2山梨酸：纯度≥99.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.1.3糖精钠：纯度≥99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.1.4标准储备液：分别准确称取苯甲酸、山梨酸和糖精钠0.118g、0.134g和0.117g（精确到0.0001g），用水溶解并分别定容至100ml。此储备液各浓度为1000μg/ml。
储备液于4℃贮存，保存期为6个月。当使用苯甲酸和山梨酸标准品时，需用甲醇溶解并定容。
3.1.5标准混合中间液：分别取苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备液各10.0ml于50ml容量瓶中，用水定容。于4℃贮存，保质期为3个月。
3.1.6标准工作液：量取标准混合中间液适量，用水稀释成浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL标准工作液。（临用现配）
3.1.7微孔滤膜：孔径0.22μm,有机相。
3.2 样品的处理
3.2.1含有胶基的果冻糖果等样品：
称取2g样品（精确到0.001g）于50ml具塞离心管中，加25mL水，置50℃水浴中加热溶解，取出后趁热超声20min, 冷却至室温，取出加入2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加2ml乙酸锌溶液，于8000r/min离心机中离心5min，取上清液于50mL容量瓶中，再加水20mL混匀后再超声5min后于8000r/min离心机中离心5min后合并上清液后再定容至刻度，上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。
3.2.2奶油、油脂、巧克力、奶油、油炸食品类样品：
称取2g样品（精确到0.001g）于50mL具塞离心管中，加入10mL正己烷，置60℃水浴加热约5min，并不时轻摇以溶解脂肪，然后加25mL氨水溶液（1+99）1mL乙醇，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min，冷却至室温后，加2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2ml乙酸锌溶液，于8000r/min离心机中离心5min，弃去有机相，水相转移至50mL容量瓶中，再加水20mL混匀后再超声5min，后于8000r/min离心机中离心5min后合并上清液后再定容至刻度，上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。
3.2.3一般试样：
称取2g样品（精确到0.001g）于于50mL离心管中加水25mL，在 50℃超声振荡提取20min后冷却至室温，取出加入2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2ml乙酸锌溶液，于8000r/min离心机中离心5min取上清液于50mL容量瓶中，再加水20mL混匀后再超声5min后于8000r/min离心机中离心后合并上清液后再定容至刻度，上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。
3.3仪器测定条件
3.3.1色谱柱：C18柱, 250mm×4.6mm，5μm，或相当者。
3.3.2流动相：甲醇+乙酸铵溶液=5+95。
3.3.3流速：1.0ml/min
3.3.4波长：230nm
3.3.5进样量：10μl
（注：当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，甲醇+甲酸-乙酸铵=8+92）
四、结果处理

结果表述:
式中：X -试样中各组分的含量，(g/kg)； m-样品的质量，（g）；
C-标准品的浓度，(μg/mL)； V-样品最终定容体积，(mL)。
五、验证结果
1.线性结果
A.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
苯甲酸 Y=34718.4*X-2258.22 R^2=0.9999618

表1 苯甲酸标准系列试验结果

（μg/mL）	0.1	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0
A	3192	6472	15547	30792	171991	346341	857154	1737605

以上结果表明苯甲酸在0.1μg/mL ~50.0μg/mL范围内，R=0.9999809,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
B.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
山梨酸 Y=58106.6*X-2551.27 R^2=0.9998775

表1 山梨酸标准系列试验结果

（μg/mL）	0.1	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0
A	6078	11004	27220	53019	266472	599121	1449933	2900929

以上结果表明山梨酸在0.1μg/mL ~50.0μg/mL范围内，R=0.9999387,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
C.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
糖精钠 Y=28974.4*X-9635.15 R^2=0.9993261

表1 糖精钠标准系列试验结果

（μg/mL）	0.1	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0
A	1855	4407	12203	25090	130262	261748	693650	1453554

以上结果表明糖精钠在0.1μg/mL ~50.0μg/mL范围内，R=0.9996630,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
A.将0.2μg/mL苯甲酸标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出苯甲酸的方法检出限为 0.005mg/kg，此检出限结果满足条件。
B..将0.2μg/mL苯甲酸标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出山梨酸的方法检出限为 0.005mg/kg，此检出限结果满足条件。
C.将0.2μg/mL苯甲酸标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出苯甲酸的方法检出限为 0.005mg/kg，此检出限结果满足条件。
七、重复性测定
A.对样品F1807000281进行7次进样，其苯甲酸测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X_平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0223	6.02	50	0.149	0.149	0.10
2	2.0237	6.023	50	0.149
3	2.0186	6.002	50	0.149
4	2.0212	6.012	50	0.149
5	2.03264	6.033	50	0.148
6	2.0201	6.007	50	0.149
7	2.0195	6.004	50	0.149

本方法的精密度为 0.10% ，符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
B.对样品F1807000281进行7次进样，其山梨酸测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X_平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0223	5.748	50	0.142	0.142	1.44
2	2.0237	5.727	50	0.141
3	2.0186	5.722	50	0.142
4	2.0212	5.702	50	0.141
5	2.03264	5.882	50	0.145
6	2.0201	5.657	50	0.14
7	2.0195	5.887	50	0.146

本方法的精密度为 1.44% ，符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
C.对样品F1807000281进行7次进样，其糖精钠测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X_平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0223	5.891	50	0.146	0.145	0.64
2	2.0237	5.882	50	0.145
3	2.0186	5.887	50	0.146
4	2.0212	5.857	50	0.145
5	2.03264	5.85	50	0.144
6	2.0201	5.821	50	0.144
7	2.0195	5.793	50	0.143

本方法的精密度为 0.64% ，符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
六、准确度验证（加标回收）
A.对样品F1807000281加标，取苯甲酸浓度100 .0 μg/mL的标液 0.01mL、0.04mL和0.1ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		苯甲酸
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X_平（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	2.0225	50	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0236	50	N.D	N.D	N.D	/	/
加标1#	2.0216	50	0.984	0.024	/	0.0247	98.4
加标2#	2.0222	50	4.167	0.103	/	0.099	104
加标3#	2.0307	50	9.931	0.245	/	0.246	99.6

由上表可以看出苯甲酸的加标回收范围在98.4%-104.0% ，RSD值为2.93%符合规定要求。
B.对样品F1807000281加标，取苯甲酸浓度100 .0 μg/mL的标液 0.01mL、0.04mL和0.1ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		山梨酸
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X_平（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	2.0225	50	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0236	50	N.D	N.D	N.D	/	/
加标1#	2.0216	50	0.982	0.0242	/	0.0247	98
加标2#	2.0222	50	3.986	0.099	/	0.099	100
加标3#	2.0307	50	9.196	0.226	/	0.246	91.9

由上表可以看出苯甲酸的加标回收范围在91.9%-100.0% ，RSD值为4.37%符合规定要求。
C.对样品F1807000281加标，取苯甲酸浓度100 .0 μg/mL的标液 0.01mL、0.04mL和0.1ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		糖精钠
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X_平（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	2.0225	50	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0236	50	N.D	N.D	N.D	/	/
加标1#	2.0216	50	0.95	0.0235	/	0.0247	95.1
加标2#	2.0222	50	4.063	0.1	/	0.099	101
加标3#	2.0307	50	9.398	0.231	/	0.246	93.9

由上表可以看出苯甲酸的加标回收范围在93.9%-101.0% ，RSD值为3.93%符合规定要求。
七、总结
本方法的检出限为0.005mg/kg。等于GB 5009.28-2016中给出的最低检出浓度0.005mg/kg。本方法的精密度分别为2.93%、4.37%和3.93%。符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求.通过对食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法的检出限、精密度和准确度的评价，本方法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠数据准确，结果可信。此方法的准确性好，测定结果真实可靠，可用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。

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夏天的雪

第1楼2018/07/30

应助达人

对样品只给了编号，没有给出具体种类，不知道加的是哪种样品；想请教一下，对于胶基糖果，加热后溶解效果较好，放置室温后会不会再次成为凝胶状？

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devil_hv1

第2楼2018/07/30

灌水貼
夏天的雪(bingwang228)发表:对样品只给了编号，没有给出具体种类，不知道加的是哪种样品；想请教一下，对于胶基糖果，加热后溶解效果较好，放置室温后会不会再次成为凝胶状？

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夏天的雪

第3楼2018/07/31

应助达人

灌水应该不算，但是没有创新内容是真。前半部分是标准的重复，后半部分是数据的填充，如果加上实验过程的分享，突出某些重点，倒也是一个很好的经验交流原创帖
devil_hv1(devil_hv1) 发表:灌水貼

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检测老菜鸟

第4楼2018/07/31

应助达人

食品方法验证看的太多，这个中规中矩，现在想看环境方面方法验证

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sdlzkw007

第5楼2018/07/31

应助达人

如果不是作者笔误，按照0.005mg/kg的检出限计算出仪器的最低检测浓度是0.005ug/g*2g/50ml=0.2ug/L，在此浓度下的绝对进样量是10ul的话相当于2纳克，在230nm的波长下完全看不到峰！个人观点，仅供参考！！

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【四季风】

第6楼2018/08/05

不管用那种测定方法，我认为应根据食品标签给出的添加剂舍量与测定仪器的灵敏感度决取样量。样品的处置也很重要，样品经各种试剂处理后，水相应全部定容后再离心或过虑处理，再取上清液或虑液测定，这样的样品体积在计算时较为准确。

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夏天的雪

第7楼2018/08/07

应助达人

看的认真，算的明白
sdlzkw007(sdlzkw007) 发表:如果不是作者笔误，按照0.005mg/kg的检出限计算出仪器的最低检测浓度是0.005ug/g*2g/50ml=0.2ug/L，在此浓度下的绝对进样量是10ul的话相当于2纳克，在230nm的波长下完全看不到峰！个人观点，仅供参考！！

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夏天的雪

第8楼2018/08/07

应助达人

没有接触过环境，环境对方法验证有何特殊要求
检测老菜鸟(v3295053) 发表:食品方法验证看的太多，这个中规中矩，现在想看环境方面方法验证

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夏天的雪

第9楼2018/08/07

应助达人

标签貌似不提供含量，定量限应该与取样量和稀释倍数有关的
【四季风】(gpwrx) 发表:不管用那种测定方法，我认为应根据食品标签给出的添加剂舍量与测定仪器的灵敏感度决取样量。样品的处置也很重要，样品经各种试剂处理后，水相应全部定容后再离心或过虑处理，再取上清液或虑液测定，这样的样品体积在计算时较为准确。