分子生物学实验操作要点及防污染策略

栀子花开

2020/06/01
解密双螺旋团队

私聊

PCR

分子生物学实验操作要点及防污染策略

0前言

分子生物学实验，对于动物疫病监测实验室来说是个新事物。由于其极高的扩增效率，操作稍有不慎即可造成污染。下面是动物分子生物学操作要点，以及防污染的一些策略，内容很具体也很啰嗦，但严格遵守的话可以大大提高操作成功率，并尽可能减少交叉污染，供参考。

1 总体原则

1.1 严格做好分区。一般应设置样品处理、核酸提取和核酸扩增三个区，对于普通PCR还应设置核酸检测区。

1.2 避免接触过高浓度样品（如阳性对照）内壁的手套、器具，再次接触其他样品（如待检样品）的内壁。

1.3 避免打开扩增产物的容器，因其含有高浓度目标片段。

2 设备防污染

2.1 消毒剂选择

平常所说的消毒剂，与分子生物学实验所说的消毒剂，概念上有一些差异。以非洲猪瘟为例：

平常所说的消毒剂，是指杀灭病毒的活性，使其不再具备感染能力。故常采用0.8%氢氧化钠溶液，作用时间30min。

而分子生物学实验的消毒，其着重点是破坏病毒核酸，使其不对后续实验产生污染。常采用有效氯含量3g/L的氯制剂溶液，对于有效氯含量30%的消毒药，配制成1%的溶液即可。由于氯制剂对金属表面有较强的腐蚀性，所以消毒时间应控制在1~3min。

2.2 生物安全柜

撤出柜内所有物品，向柜壁（除上部）喷洒含氯消毒剂，作用1min后用纸巾擦干，注意不同区域更换纸巾；有条件的可再喷洒核酸祛除剂，作用1min后用纸巾擦干。

2.3 离心机

卸下转子，用带含氯消毒剂的纸巾擦拭内壁，然后用带洁净水的纸巾擦拭内壁，最后用干的纸巾擦干。转子浸泡于含氯消毒剂中作用1min，然后用清水冲洗干净，晾干或低温烘干。

2.4 移液器及支架

用带含氯消毒剂的纸巾擦拭，尤其是移液器头部容易接触离心管壁处。然后用带洁净水的纸巾擦拭，最后用纸巾擦干。

3 器具防污染

3.1 不锈钢剪刀、镊子

做好一个样品一把，使用后浸泡于含氯消毒剂中，实验完毕后清洗，然后高温烘干。

不同分区的剪刀、镊子专用。用于夹取洁净物品的镊子，也应经常消毒、清洗并高温烘干。

3.2 离心管

一次性使用，以无DNA/RNA酶的洁净离心管为佳。

不同分区的离心管应专用。

3.3 移液器吸头

一次性使用，以带滤芯的无DNA/RNA酶的洁净吸头为佳。

不同分区的吸头及吸头盒应专用。

4 防护用品

4.1工作服

不同分区的专用，经常消毒、清洗并晾干。

条件允许的情况下，不同分区的工作服，应采用不同颜色予以区分。

4.2 手套、口罩

一次性使用。怀疑手套被污染即应脱下，并更换新的手套。

4.3 鞋套、帽子

条件允许的情况下，建议使用鞋套、帽子。

5 样品处理

5.1 外包装处理

对于高致病性样品（如怀疑感染非洲猪瘟样品），应对外包装进行处理，流程如下：

收到样品后，除去最外层包装如泡沫箱（送样前已进行消毒），对内层外包装（如塑料袋、封口袋）喷洒0.8%氢氧化钠溶液，作用30min。为防止溶液干燥，需间隔10-15min再次喷洒，然后用纸巾擦干。

除去内层外包装，对最小包装（如抗凝管等）喷洒0.8%氢氧化钠溶液，作用30min。为防止溶液干燥，需间隔10-15min再次喷洒。然后用纸巾擦干。

5.2 样品灭活处理

某些高致病性样品（对人或动物），需要进行灭活后才能进行后续处理。液体样品需灭活后再进行后续操作，固体样品可在匀浆后进行灭活，然后再进行后续操作。

5.3 开放式操作

所有开放式操作，如倾倒、加样等，需在生物安全柜内操作。

5.4 抗凝血处理

对外包装消毒处理后，取出抗凝管，颠倒数次混匀管内液体，然后转移入离心管。

对于需要分离血浆的，以10000r/min离心5min，然后分离血浆，转入洁净离心管。

对于需要混样的，从待检样品中吸取一定量抗凝血或血浆，转入洁净离心管，做到每个样品换一个吸头。

5.5 拭子处理

观察离心管内残留保存液体积，如不足所需量可适当加入PBS液补足。单样检测的，可补至液体量500μL左右，混样检测的可补至200μL左右。

为避免交叉污染，不建议用镊子夹住拭子反复挤压方式处理拭子，推荐用涡旋后离心方式进行处理。具体操作方式：补足液体容量后，将离心管置于涡旋混匀器上涡旋1min，然后以10000r/min离心5min，吸取上清液200μL，转入洁净离心管。

5.6 组织样品处理

采用多点取样方式，从组织不同部位剪取一定量样品，剪碎混合后取100mg左右置于匀浆管内（预先放入钢珠），加入PBS液1mL，置于组织匀浆机进行匀浆。取出后以10000r/min离心5min，吸取上清液200μL，转入洁净离心管。

注：对于RNA病毒，建议加入的PBS液进行预冷处理。且一次匀浆时间不宜过长，可分为几次处理，匀浆一次后取出置于冰水中冷却，然后进行下一次匀浆。

6 核酸提取

一般采用柱式提取或磁珠法提取，以柱式提取为例：

6.1 试剂准备

有些试剂盒需要自配无水乙醇、异丙醇或蛋白酶K等试剂，需提取准备好。

有些试剂盒内的部分试剂，在首次使用前需加入一定量的无水乙醇，按需要量予以补足。

有的试剂盒，含有冷冻保存的试剂（如蛋白酶K），需提前取出室温融化或适当水浴融化。

大多数小容量试剂（2mL以内），均需在使用前先进行瞬时离心，将试剂甩至容器底部。

部分试剂盒内附的洗脱液（如TE），对于后续PCR反应效果不佳。改用灭菌水洗脱时，应先将冷冻保存的灭菌水，提前取出室温融化或适当水浴融化。

注：灭菌水制备：(1)取洁净耐高温试剂瓶（如蓝盖玻璃试剂瓶），装入80%容量超纯水，盖上瓶盖稍旋几圈不要盖紧，置于高压灭菌器121℃30min，冷却后取出，盖紧瓶盖，置于药品冷藏箱暂存。(2)取1.5mL洁净离心管，加入灭菌水约1mL，做好标记，冷冻保存。

6.2 裂解

加入裂解液对样品进行裂解。

样品排列时应注意保持一定的距离，离心管之间最少应间隔一个孔位，以避免离心管打开后，不同离心管盖内壁相互触碰造成交叉污染（下同）。

加液时注意吸头不要触碰到离心管任何部位，否则应更换吸头，并重新制备可能受到污染的样品。

放入和取出离心管时，宜用镊子操作，避免手直接接触离心管。

如果需要进行混匀操作，要尽量温和，一般采用颠倒10次的方式进行混匀。

如需水浴，应在实验开始前开启水浴锅提前预热，以免影响实验进度。水浴锅内的离心管架应经常消毒、清洗，避免交叉污染。

从水浴锅内取出离心管后，用纸巾擦干水分，置于原离心管架。

6.3 结合

待离心管内液体稍冷却后，将液体转移入吸附柱内，待反应几分钟后，以10000r/min离心1min，弃去收集管内液体。

转移液体时，可采取直接倒入，或用移液器转移，注意随时更换吸头。

液体转移入吸附柱后，应等待几分钟，以利核酸与吸附柱的膜充分结合。

弃去收集管内液体，可直接倒出，或用吸管吸出。如直接倒出，应将收集管倒置在纸巾上吸干液体，注意每支收集管在纸巾上的位置应不同。

离心时放入和取出离心管，宜用镊子操作，避免手直接接触离心管。

6.4 洗涤

分三次用洗涤液洗涤吸附柱，其中第一次为高盐洗涤液，后两次为低盐洗涤液。

操作注意事项基本同上。最后一次洗涤离心后，应将吸附柱与收集管（空管），以10000r/min离心2min，彻底去除液体。

因洗涤液含有较高含量乙醇，对后续的PCR反应有一定程度的影响。因此空管离心后，应打开收集管盖，静置5-10min，待乙醇充分挥发后再进行洗脱。

6.5 洗脱

将吸附柱置于洁净离心管上，加入洗脱液，2min后盖上离心管盖，剪去吸附柱盖，以10000r/min离心1min，离心管底部液体即为所提取的DNA/RNA。

提取DNA时，可将洗脱液预热至60℃左右，提高洗涤效率。

加入洗脱液时，应注意尽量覆盖整个吸附膜，提高洗脱效果。

加入洗脱液后，应静置几分钟，让洗脱液与吸附膜上的核酸充分结合。

离心前应尽可能剪去吸附柱盖，避免吸附柱盖内壁与其他离心管及离心机部件接触造成交叉污染。

提取所得的DNA/RNA，应冷冻保存（建议保存于-70℃冰箱）。如需立即进行扩增的，可于当日冷藏暂存（不得过夜）。

7核酸扩增

核酸扩增试剂有多种：(1)单管试剂：所有组分混合在一管；(2)双管试剂：酶制剂单独为一管，其他试剂为一管，使用前按比例混合；(3)多管试剂：预混液、酶、引物、探针均单独一管，使用前需按照扩增体系临时配制。

不管何种试剂，使用方式大同小异，注意事项如下：

所有试剂使用前均需提前室温融化或适当水浴融化，并瞬时离心将试剂甩至管底；

吸取试剂时每次更换新的吸头（建议采用带滤芯吸头）；

除单管试剂外，其余试剂建议先将所有组分的总量配制成混合液，瞬时离心后分配到PCR管内。

配制混合液时，试剂应增加适当余量：10份检测（含对照）多配0.5份，20份检测多配1份，20份以上检测多配5%。使用不同的移液器、离心管、吸头，余量不一样，可以先用灭菌水多次尝试后确定余量比例。

对于ABI7500荧光定量PCR仪，如试剂内不含ROX，建议自行加入，可在一定程度上减少反应孔间的差异。对于不同设备ROX浓度不一样，一般ABI7500应选用ROX II（低浓度）。

加入DNA/RNA时，应按阴性对照、待检样品、阳性对照顺序加入。

所有试剂及DNA/RNA加样完毕后，盖上PCR管盖，做好标记。轻摇PCR管混合所有成分（不建议DNA/RNA加样时吹打混合，极易造成移液器污染），瞬时离心后上机。

由于荧光定量PCR仪多采用Peltier进行控温，不可避免带入边缘效应，因此PCR管一般应放在升降温模块的较中间位置较好。热盖与升降温模块长期夹击之下，左右两侧的组件容易轻微变形，因此在可能的情况下，升降温模块左右两侧最好各放置一排洁净的空PCR排管，以降低组件变形的可能。

荧光定量PCR仪的升降温模块需进行一段时间的预热，才能达到较好的扩增效果，因此扩增时最好提高30min打开设备予以预热。灯泡、升降温模块都有一定的寿命，因此扩增结束后尽可能及时关机。

扩增产物尤其是阳性对照孔中，扩增片段的浓度非常高，特别是部分Ct值低于20的阳性对照。因此扩增结束后，应及时取出扩增产物PCR管，投入含氯消毒剂中，反应一段时间后弃去，切勿打开PCR管。

由于难免存在PCR管未盖紧或扩增过程中轻微裂开等因素，升降温模块可能会受到污染。因此在开展一段时间检测后，应使用棉签沾无水乙醇擦拭升降温模块各孔，并等待无水乙醇充分挥发后再进行扩增检测。

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