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生物实验中的基础操作—铺板,流式及蛋白浓度测定
吃饭请叫我
2023/10/08
小矮马
私聊
生物制药
生物实验中的基础操作
—
铺板,流式及蛋白浓度测定
铺板
以每孔
1
×
10
4
个细胞平铺于
96
孔板中,
37
°C
恒温培养箱中培养。铺板后,分别于
24 h
、
48 h
、
72 h
、
96 h
、
120 h
在每孔加入
10
μ
L
CCK-8
溶液,
37
°C
恒温培养箱中孵
4 h
。并用酶标仪测定波长
450 nm
处
OD
值,利用
Graphpad
prism5
计算增殖情况。
流式细胞术
1.
收集对照组和实验组细胞
(
包括培养上清中的细胞
)
,收集
1
-
10 ×10
5
个
细胞,用预冷
PBS
离心洗涤。用双蒸水稀释
5×Binding Buffer
为
1 ×
工作液,取
500
μ
L
1 × Binding Buffer
重悬细胞。
2.
每管加入
5
μ
L
Annexin V-APC
和
10
μ
L
7-AAD
。
3.
轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育
5
min
。
4.
上机进行分析
。
细胞总蛋白质提取,测定蛋白浓度及蛋白变性
将对数生长期的对照组及实验组细胞移入
15 mL
离心管中,
900 rpm/min
离心
8 min
,并用
PBS
溶液洗涤
2
次,以去除培养基中血清的影响。分别加入
100 μL
蛋白裂解液,与细胞充分混匀。冰上裂解
1
小时后,
4
°C
,
12000 rpm/min
离心
15 min
,将上清移至新的离心管中,得到细胞总蛋白,并采用
BCA
法测定蛋白浓度。
蛋白免疫印迹实验
配制浓度为
10%
或
12%
的分离胶,加入最后
TEMED
试剂搅拌均匀后,迅速灌胶,用
乙醇压齐分离胶
。待分离胶凝固后,弃去上层的乙醇,用滤纸将乙醇吸干,注意不要
将纸屑污染胶板。配制浓缩胶,插入梳子,
待胶凝固
。开始凝胶电泳实验,缓慢拔出梳子,将胶夹紧放入电泳槽,槽内倒入电泳液,蛋白样品以等质量上样,按照实验设计加入蛋白
Marker
和
1
×
上样缓冲
液。
上层胶
用
60 V
电压,样品跑至下层分离胶时,电压调至
90 V
,继续
跑胶至
蓝线到达分离胶底部停止。将
PVDF
膜浸泡在甲醇中约
30 s
激活后备用。
将转膜夹板
、滤纸、胶按照“黑板—滤纸—凝胶—
PVDF
膜—滤纸—白板”的顺序夹好备用,注意每一层避
免产生气泡。
转膜槽中
放入夹板,周围放入冰袋,倒入
转膜液
,恒流
200mA
转膜
2.5 h
(
转膜时间
根据分子量大小设置)。用
TBST
配制
5%
牛奶封闭液对
PVDF
膜进行封闭,
转膜完成
后,将转好的膜放入封闭盒内,倒入牛奶封闭液,室温,摇床
上慢摇孵育
2 h
。
洗膜
: TBST
洗
3
次,每次
10 min
。配制
一
抗,
4
°C
孵育过夜。洗膜,配制二抗,室温静孵
1 h
。
TBST
洗
3
次,每次
10 min
。配制
ECL
发光液,室温条件下孵育
3 min
,
ECL
显影,化学发光成像仪曝光,保存图片。
附件:
2-5 生物实验中的基础操作—铺板,流式及蛋白浓度测定 .docx
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