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【“仪”起享奥运】双缩脲法测定蛋白含量的方法

小卡

2024/08/09

食品常规理化分析

1.原理

在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围1~10mg蛋白质。

双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，使其有利于对蛋白质纯化早期步骤的测定。

干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，例如 Tris 缓冲液，因为它们给予阳性呈色反应。Cu2+也容易被还原，有时发现出现红色沉淀。

2.试剂和器材

①试剂

标准酪蛋白溶液（10mg/mL)：酪蛋自要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量配制成标准溶液。用0.05mol/L 氢氧化钠溶液配制。亦可用10mg/ mL 牛血清清蛋白溶液。

双缩脲试剂：取1.50g硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O )，用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000mL，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。

②器材

分光光度计，恒温水浴

3．操作方法

标准曲线的制定：取12只试管分成两组，分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL的标准酪蛋白溶液，用水补足到1mL，然后各加入4mL双缩脲试剂，充分摇匀后，在室温下（20~25℃）放置30分钟，于540nm处进行比色测定。取两组测定的平均值，以酪蛋白的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。

用同样的方法测定未知样品，注意样品浓度每ml不要超过10mg，否则要适当稀释。

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