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【金秋计划】革兰氏染色法
Ins_d6b56fa6
2024/09/06
私聊
食品常规理化分析
革兰氏染色法(
Gram Staining
)是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,将细菌分成两类,即革兰氏阳性(
GramPositive
,
G
+
)与革兰氏阴性(
Gram Negative
,
G
-
)。
一、实验原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,
革兰氏阳性菌
由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色。
革兰氏阴性菌
因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。
二、染液的配制
1.结晶紫染液:
结晶紫乙醇饱和液(结晶紫
2g
溶于
20mL95%
乙醇中)
20mL
,
1%
草酸铵水溶液
80mL
,将两液混匀置
24h
后过滤即成。
2.卢戈氏碘液:
碘
0.33g
,碘化钾
0.66g
,蒸馏水
100mL
。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加蒸馏水至
100mL
即成。配成后贮于棕色瓶内备用,如变为黄色即不能使用。
3.95%乙醇:
用于脱色。
4.番红溶液:
番红
O2.5g
,
95%
乙醇
100mL
,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中,用时取
20mL
与
80mL
蒸馏水混匀即可。
三、应用
应用于细菌检测,细菌的鉴别和分类,病毒的检测以及生物样品的特性分析。
四、实验步骤
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法如下:
1.制
片:固定,操作同上;
2.初
染:滴加草酸铵结晶紫染色1min,水洗;
3.
媒染:滴加革兰氏碘液(碘-碘化钾溶液)染色1min,水洗;
4.脱
色:滴加体积分数为95%的乙醇,约45s后水洗;
5.复
染:滴加番红染液染色3min,水洗并使之干燥;
6.
镜检:革兰氏阳性菌呈
紫色
,革兰氏阴性菌呈
红
色
。
五、影响因素及注意事项
1.假阴性
选用活跃生长期菌种染色,老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性。
2.假阳性
涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
3.涂片加热
如用火焰固定涂片时,将涂面向上,通过火焰数次,以手接触玻片,稍感烫手时即可。要防过热,否则使细菌变形或影响染色反应。
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