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【金秋计划】碱裂解法小规模提取质粒DNA分子

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    2024/09/06
  • 私聊

食品常规理化分析

  • 一、原理碱裂解法提取质粒基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下(pH值介于12.0-12.5),染色体DNA的双螺旋结构解开而变性,而质粒DNA虽然氢键断裂,但两条互补链仍紧密结合在一起。

    当加入中和液(如pH4.8的KAc缓冲液)恢复中性时,质粒DNA迅速复性并保持可溶性状态,而染色体DNA则形成不溶性网状结构。通过离心,可将染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,与质粒DNA分离,最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

    二、相关溶液的配制

    1.碱裂解溶液 I


    50mL 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA,115灭菌30min。

    2.碱裂解溶液 II

    0.2N NaOH,1% SDS(现配现用)。

    3.碱裂解溶液pH 4.8III

    5M KAc60mL,冰醋酸 11.5mL,蒸馏水28.5mL4.抗生素5.乙醇:70%95%6.饱和重蒸酚∶氯仿:异戊醇=25:24:1 (v/v)

    7.TE(pH8.0):
    100mM Tris-HCl pH 8.010mM EDTA pH 8.0

    8.STE缓冲液

    含有20μg/L RnaseATE (pH8.0)缓冲液

    9.LB培养基(Media)(g/L

    蛋白胨 10g,酵母膏5g,氯化钠10gpH7.5
    三、详细操作步骤(大肠杆菌为例说明)
    1.活化菌种:


    不同保藏方式要采用不同的活化方式,注意无菌操作。

    2.细菌培养:挑取单菌落接种于液体培养基中(含抗生素),37℃振荡培养过夜。

    不同的微生物培养方式不同,注意液体培养基的体积不超过三角瓶容积的1/10

    3.收集细菌:移液枪将上述培养液加入1.5mL离心管中,4°C3000g/min离心1min,去上清,收集菌体,尽可能地吸干水分,不能碰到沉淀。(质粒存在于细菌内,收集菌体为了提取质粒。)
    4.洗涤:用STE重悬菌体,离心后收集菌体,重复2-3次。

    洗涤菌体是为了去除杂质和残留物,?提高质粒的纯度和质量。?

    5.碱裂解溶液 I: 加入100μL预冷的碱裂解溶液 I 并利用振荡器重悬菌体。碱裂解溶液I的作用是悬浮菌体,改变细胞膜的通透性。葡萄糖可以增加溶液的黏稠度,使菌体细胞不至于快速沉降。对提取质粒影响不大,可有可无;
    Tris-HCl控制溶液的pH;EDTA金属离子螯合剂,能够螯合细胞内所有Ca2+Mg2+等二价金属离子,如果快速提取质粒的话,也可以不添加EDTA总结,如果没有碱裂解溶液 I也可以进行质粒抽提。
    6.裂解液溶液Ⅱ:向每个细菌重悬液内加入200μL新鲜配制的碱裂解溶液II,盖上试管,并快速倒置试管五次,冰浴溶液Ⅱ的作用是使DNA变性,SDS的作用在于使细胞裂解,以释放出质粒DNA和染色体DNA,在高pH(12.0~12.5)条件下,破坏碱基配对,使DNA变性。NaOH作用是溶解细胞释放DNA。因为在强碱性的情况下,细胞膜磷脂双分子层发生结构变化,导致细胞裂解,DNA得到释放。氢氧化钠与SDS联用,还能够增强自身的强碱性。SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜,从而释放出细胞内容物(Lysate),还可以使蛋白变性并结合到蛋白质表面,成为“R-O-S03—…R十-蛋白质”的复合物而使其沉淀下来。pH12.0-12.5的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂、双螺旋结构解开并降解成片段,共价闭环的质粒 DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕。注:不要用振荡器!防止基因组DNA断裂,从而影响目标产物的提取。
    7. 裂解液溶液III:加入150μL冰冷的碱裂解溶液III,盖上离心管,之后倒置数次以使溶液充分混合,之后冰浴3-5min溶液Ⅲ的作用是使DNA复性。线状染色体DNA聚集成不可溶的网络状聚合物,而质粒DNA得以完全复性。同时高浓度的KAc会引起蛋白质-SDS复合物和高分子质量的RNA分子发生沉淀。

    KAc的作用是沉淀蛋白质和宿主DNA,其原理是K+置换SDS中的Na+而形成PDS,而PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

    冰醋酸的主要作用是中和NaOH,调整缓冲液的pH值。染色体DNA在改变缓冲液pH值后发生复性,但是无法恢复原来的天然双链结构,而是反应后形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构,同时高浓度的钾盐溶液可以让SDS-蛋白质-染色体DNA复合物以沉淀析出。接下来通过高速离心,SDS-蛋白质-染色体DNA复合物、以及其他的细胞裂解物全部沉淀管底,最终只有质粒DNA溶解在上清中。
    8. 离心:把经过上述溶液处理的细菌裂解液在低温离心机上高速离心5min,之后把上清液小心转移至一离心管中。


    (质粒DNA在上清中,染色体DNA在沉淀中。)

    9. 除蛋白脂类等杂质:加入等体积的酚-氯仿-异戊醇,通过震荡器使之充分混合。在4°C微型离心机上高速离心2min,把离心后上层水相转移至干净离心管。酚-氯仿-异戊醇的主要作用是分离DNA和杂质蛋白。?酚的作用主要体现在其强烈的蛋白质变性能力,?能有效使蛋白质变性而除去。?酚是强烈的蛋白质变性剂,?通过使蛋白质变性,?从而帮助去除蛋白质杂质,?使DNA和杂质蛋白得以分离。?氯仿的作用在于强烈的脂溶性和加快有机相与液相的分层能力。?氯仿有助于去除脂类杂质,?加快有机相与液相的分层。?

    (上层水相含质粒DNA、中间变性蛋白相、下层有机溶剂相的稳定分层。)

    10. 除盐:室温下加入2倍体积的乙醇,沉淀核酸,通过振荡器打匀之后,室温下静置2min乙醇的作用主要是去除溶液中的盐杂质,?以便去除,提高质粒的纯度。

    (乙醇溶解杂质,在上清,质粒DNA在沉淀。)

    11. 离心收集沉淀:通过高速离心机4°C离心5min,收集沉淀的核酸。

    (质粒DNA在沉淀,收集沉淀。)

    12. 按照试验步骤3所描述的方法,吸掉上清液。之后,把离心管倒置于纸巾上,使管内所有的液体流出。同时,可以利用枪头除去管壁上可能黏附的液滴。

    (质粒DNA在沉淀。)

    13. 洗涤:加入1mL70%的乙醇,反复倒转离心管数次,之后于4°C离心机上高速离心2-5min

    继续洗去杂质,纯化质粒DNA。

    14. 除上清:按照试验步骤3所描述的方法除去离心管中上清液。此过程要多加小心,以免因为核酸沉淀和管壁接合不牢而被吸去。

    (质粒DNA在沉淀。)

    15. 除乙醇:除去离心管侧壁上所有的乙醇液滴。把离心管开口置于室温直至其中乙醇都被蒸发掉,约需要5-10min

    这个过程不可时间过长,会导致DNA脱水而难以溶解并可能变性。

    16. 贮存:把所制备的核酸溶于50μLTE(含有20μg/mL不含DnaseRnase A, pH8.0)缓冲液中,利用震荡器轻微震荡几秒钟,使核酸沉淀充分溶解。所制备DNA溶液贮存于-20°C内。
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