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【金秋计划】碱裂解法小规模提取质粒DNA分子

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2024/09/06

食品常规理化分析

一、原理碱裂解法提取质粒基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下（pH值介于12.0-12.5），染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，而质粒DNA虽然氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合在一起。

当加入中和液（如pH4.8的KAc缓冲液）恢复中性时，质粒DNA迅速复性并保持可溶性状态，而染色体DNA则形成不溶性网状结构。通过离心，可将染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，与质粒DNA分离，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

二、相关溶液的配制

1.碱裂解溶液 I

50mL 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA，115℃灭菌30min。

2.碱裂解溶液 II

0.2N NaOH，1% SDS（现配现用）。

3.碱裂解溶液（pH 4.8）III：

5M KAc60mL，冰醋酸 11.5mL，蒸馏水28.5mL。4.抗生素5.乙醇：70% 和95%6.饱和重蒸酚∶氯仿:异戊醇=25：24：1 (v/v)

7.TE(pH8.0)：100mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0。

8.STE缓冲液

含有20μg/L RnaseA 的TE (pH8.0)缓冲液

9.LB培养基（Media）（g/L）

蛋白胨 10g，酵母膏5g，氯化钠10g，pH7.5。
三、详细操作步骤（大肠杆菌为例说明）
1.活化菌种：

不同保藏方式要采用不同的活化方式，注意无菌操作。

2.细菌培养：挑取单菌落接种于液体培养基中（含抗生素），37℃振荡培养过夜。

不同的微生物培养方式不同，注意液体培养基的体积不超过三角瓶容积的1/10。

3.收集细菌：用移液枪将上述培养液加入1.5mL离心管中，4°C、3000g/min离心1min，去上清，收集菌体，尽可能地吸干水分，不能碰到沉淀。（质粒存在于细菌内，收集菌体为了提取质粒。）
4.洗涤：用STE重悬菌体，离心后收集菌体，重复2-3次。

洗涤菌体是为了去除杂质和残留物，?提高质粒的纯度和质量。?

5.碱裂解溶液 I： 加入100μL预冷的碱裂解溶液 I 并利用振荡器重悬菌体。碱裂解溶液I的作用是悬浮菌体，改变细胞膜的通透性。葡萄糖可以增加溶液的黏稠度，使菌体细胞不至于快速沉降。对提取质粒影响不大，可有可无；
Tris-HCl控制溶液的pH；EDTA金属离子螯合剂，能够螯合细胞内所有Ca²⁺、Mg²⁺等二价金属离子，如果快速提取质粒的话，也可以不添加EDTA；总结，如果没有碱裂解溶液 I也可以进行质粒抽提。
6.裂解液溶液Ⅱ：向每个细菌重悬液内加入200μL新鲜配制的碱裂解溶液II，盖上试管，并快速倒置试管五次，冰浴。溶液Ⅱ的作用是使DNA变性，SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒DNA和染色体DNA，在高pH(12.0~12.5)条件下，破坏碱基配对，使DNA变性。NaOH作用是溶解细胞释放DNA。因为在强碱性的情况下，细胞膜磷脂双分子层发生结构变化，导致细胞裂解，DNA得到释放。氢氧化钠与SDS联用，还能够增强自身的强碱性。SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜，从而释放出细胞内容物(Lysate)，还可以使蛋白变性并结合到蛋白质表面，成为“R-O-S03—…R十-蛋白质”的复合物而使其沉淀下来。在pH值12.0-12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋结构解开并降解成片段，共价闭环的质粒 DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕。注：不要用振荡器！防止基因组DNA断裂，从而影响目标产物的提取。
7. 裂解液溶液III：加入150μL冰冷的碱裂解溶液III，盖上离心管，之后倒置数次以使溶液充分混合，之后冰浴3-5min。溶液Ⅲ的作用是使DNA复性。线状染色体DNA聚集成不可溶的网络状聚合物，而质粒DNA得以完全复性。同时高浓度的KAc会引起蛋白质-SDS复合物和高分子质量的RNA分子发生沉淀。

KAc的作用是沉淀蛋白质和宿主DNA，其原理是K⁺置换SDS中的Na⁺而形成PDS，而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

冰醋酸的主要作用是中和NaOH，调整缓冲液的pH值。染色体DNA在改变缓冲液pH值后发生复性，但是无法恢复原来的天然双链结构，而是反应后形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构，同时高浓度的钾盐溶液可以让SDS-蛋白质-染色体DNA复合物以沉淀析出。接下来通过高速离心，SDS-蛋白质-染色体DNA复合物、以及其他的细胞裂解物全部沉淀管底，最终只有质粒DNA溶解在上清中。
8. 离心：把经过上述溶液处理的细菌裂解液在低温离心机上高速离心5min，之后把上清液小心转移至一离心管中。

（质粒DNA在上清中，染色体DNA在沉淀中。）

9. 除蛋白脂类等杂质：加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，通过震荡器使之充分混合。在4°C微型离心机上高速离心2min，把离心后上层水相转移至干净离心管。酚-氯仿-异戊醇的主要作用是分离DNA和杂质蛋白。?酚的作用主要体现在其强烈的蛋白质变性能力，?能有效使蛋白质变性而除去。?酚是强烈的蛋白质变性剂，?通过使蛋白质变性，?从而帮助去除蛋白质杂质，?使DNA和杂质蛋白得以分离。?氯仿的作用在于强烈的脂溶性和加快有机相与液相的分层能力。?氯仿有助于去除脂类杂质，?加快有机相与液相的分层。?

（上层水相含质粒DNA、中间变性蛋白相、下层有机溶剂相的稳定分层。）

10. 除盐：室温下加入2倍体积的乙醇，沉淀核酸，通过振荡器打匀之后，室温下静置2min。乙醇的作用主要是去除溶液中的盐杂质，?以便去除，提高质粒的纯度。

（乙醇溶解杂质，在上清，质粒DNA在沉淀。）

11. 离心收集沉淀：通过高速离心机4°C离心5min，收集沉淀的核酸。

（质粒DNA在沉淀，收集沉淀。）

12. 按照试验步骤3所描述的方法，吸掉上清液。之后，把离心管倒置于纸巾上，使管内所有的液体流出。同时，可以利用枪头除去管壁上可能黏附的液滴。

（质粒DNA在沉淀。）

13. 洗涤：加入1mL70%的乙醇，反复倒转离心管数次，之后于4°C离心机上高速离心2-5min。

继续洗去杂质，纯化质粒DNA。

14. 除上清：按照试验步骤3所描述的方法除去离心管中上清液。此过程要多加小心，以免因为核酸沉淀和管壁接合不牢而被吸去。

（质粒DNA在沉淀。）

15. 除乙醇：除去离心管侧壁上所有的乙醇液滴。把离心管开口置于室温直至其中乙醇都被蒸发掉，约需要5-10min。

这个过程不可时间过长，会导致DNA脱水而难以溶解并可能变性。

16. 贮存：把所制备的核酸溶于50μLTE(含有20μg/mL不含Dnase的Rnase A, pH8.0)缓冲液中，利用震荡器轻微震荡几秒钟，使核酸沉淀充分溶解。所制备DNA溶液贮存于-20°C内。

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